Molecular Modeling of the M3 Acetylcholine Muscarinic Receptor and Its Binding Site

The present study reports the results of a combined computational and site mutagenesis study designed to provide new insights into the orthosteric binding site of the human M3 muscarinic acetylcholine receptor. For this purpose a three-dimensional structure of the receptor at atomic resolution was built by homology modeling, using the crystallographic structure of bovine rhodopsin as a template. Then, the antagonist N-methylscopolamine was docked in the model and subsequently embedded in a lipid bilayer for its refinement using molecular dynamics simulations. Two different lipid bilayer compositions were studied: one component palmitoyl-oleyl phosphatidylcholine (POPC) and two-component palmitoyl-oleyl phosphatidylcholine/palmitoyl-oleyl phosphatidylserine (POPC-POPS). Analysis of the results suggested that residues F222 and T235 may contribute to the ligand-receptor recognition. Accordingly, alanine mutants at positions 222 and 235 were constructed, expressed, and their binding properties determined. The results confirmed the role of these residues in modulating the binding affinity of the ligand

Preferential binding of allosteric modulators to active and inactive conformational states of metabotropic glutamate receptors

Metabotropic glutamate receptors (mGluRs) are G protein coupled receptors that play important roles in synaptic plasticity and other neuro-physiological and pathological processes. Allosteric mGluR ligands are particularly promising drug targets because of their modulatory effects – enhancing or suppressing the response of mGluRs to glutamate. The mechanism by which this modulation occurs is not known. Here, we propose the hypothesis that positive and negative modulators will differentially stabilize the active and inactive conformations of the receptors, respectively. To test this hypothesis, we have generated computational models of the transmembrane regions of different mGluR subtypes in two different conformations. The inactive conformation was modeled using the crystal structure of the inactive, dark state of rhodopsin as template and the active conformation was created based on a recent model of the light-activated state of rhodopsin. Ligands for which the nature of their allosteric effects on mGluRs is experimentally known were docked to the modeled mGluR structures using ArgusLab and Autodock softwares. We find that the allosteric ligand binding pockets of mGluRs are overlapping with the retinal binding pocket of rhodopsin, and that ligands have strong preferences for the active and inactive states depending on their modulatory nature. In 8 out of 14 cases (57%), the negative modulators bound the inactive conformations with significant preference using both docking programs, and 6 out of 9 cases (67%), the positive modulators bound the active conformations. Considering results by the individual programs only, even higher correlations were observed: 12/14 (86%) and 8/9 (89%) for ArgusLab and 10/14 (71%) and 7/9 (78%) for AutoDock. These findings strongly support the hypothesis that mGluR allosteric modulation occurs via stabilization of different conformations analogous to those identified in rhodopsin where they are induced by photochemical isomerization of the retinal ligand – despite the extensive differences in sequences between mGluRs and rhodopsin

Molekularbiologisches Screening des CHRM2-Gens bei Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie

Die dilatative Kardiomyopathie (DCM) ist eine ätiologisch heterogene Erkrankung der Herzmuskulatur, die durch eine ventrikuläre Dilatation und eingeschränkte Pumpfunktion gekennzeichnet ist. Neben autoimmunen und infektiösen Faktoren spielen bei der Pathogenese der Erkrankung vor allem genetische Veränderungen eine Rolle. In den letzten Jahren konnten durch molekularbiologische Untersuchungen Mutationen in über 30 Krankheitsgenen bei Patienten mit DCM identifiziert werden. Neben Proteinen des Sarkomers und des Zytoskeletts zählen auch Rezeptorproteine und deren Regulatoren hierzu. Das CHRM2-Gen ist ein neues mögliches Krankheitsgen der DCM. Es befindet sich auf Chromosom 731q-35q und kodiert für den muskarinergen Acetylcholinrezeptor Typ 2 (m2AChR). Der m2AChR ist der vorherrschende muskarinerge Rezeptor am Herzen und vermittelt über sein Gi-Protein eine Reduktion der intrazellulären cAMP Konzentration. Dies senkt den Calciumeinstrom in die Myokardzelle und hat einen negativ inotropen und chronotropen Effekt. In einer Arbeit von Zhang et al. konnte bereits bei einer Familie mit familiärer DCM eine Missense-Mutation im m2AChR bei allen erkrankten Familienmitgliedern nachgewiesen werden. Ziel dieser Arbeit war es, weitere Mutationen in der kodierenden Region des CHRM2-Gens bei Patienten mit DCM zu identifizieren und einen möglichen Einfluss der Mutationen auf den klinischen Verlauf der Erkrankung zu untersuchen. Hierfür wurde aus Volblutproben von 337 an DCM erkrankten Patienten der kodierende Abschnitt des CHRM2-Gens mittels Polymeraserkettenreaktion (PCR) und single-stranded-conformation-polymorphism Gelelektrophorese (SSCP) molekularbiologisch untersucht. In der SSCP auffällige Proben wurden sequenziert. Anamnestische Daten der Patienten sowie die Ergebnisse klinisch-echokardiographischer Untersuchungen bei Einschluss der Patienten und im 1-Jahresverlauf liegen vor. In der untersuchten Patientengruppe konnten zwei neue heterozygote Missense-Mutationen sowie ein Polymorphismus identifiziert werden. Die Missense-Mutation G885A bewirkt einen Aminosäureaustausch von Valin zu Isoleucin an Position 231 im Rezeptorprotein. Durch die Mutation G1268C wird Glutamin durch Histidin an Position 358 ersetzt. Bei dem Träger dieser Mutation liegt eine familiäre Form der DCM vor und ein ebenfalls an DCM erkrankter Sohn des Indexpatienten konnte als weiterer Träger identifiziert werden. Hinsichtlich der echokardiographischen Daten, besonders im 1-Jahresverlauf, konnten bei keinem Mutationsträgern Unterschiede zu Patienten mit DCM ohne nachgewiesene Mutation gefunden werden. Die anschließende Untersuchung einer Kontrollgruppe aus 300 gesunden Blutspendern der Blutbank Marburg identifizierte keine weiteren Träger der Mutationen. Beide Mutationen bewirken eine Veränderung der Aminosäuresequenz in der dritten intrazellulären Schleife des m2AChR. Dieser Bereich ist für die Kopplung des Rezeptors an sein G-Protein und die Regulation der Rezeptordichte bzw. der Rezeptorfunktion von Bedeutung. Eine Auswirkung der Mutationen auf die intrazellulären Signaltransduktion und Calciumhomöostase ist denkbar. Insgesamt unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Rolle des CHRM2-Gens als weiteres Krankheitsgen der DCM. Die hier gezeigte Prävalenz von 0,6 % ist mit der Prävalenz von anderen etablierten Krankheitsgenen vergleichbar. Zum Verständnis der Rolle des CHRM2-Gens in der Pathogenese der DCM und um die Auswirkungen der Mutationen auf die Funktion des Rezeptorproteins abschließend zu klären, sind funktionelle Untersuchungen der mutierten Rezeptoren notwendig

A New Method for Ligand-supported Homology Modelling of Protein Binding Sites: Development and Application to the neurokinin-1 receptor

In this thesis, a novel strategy (MOBILE (Modelling Binding Sites Including Ligand Information Explicitly)) was developed that models protein binding-sites simultaneously considering information about the binding mode of bioactive ligands during the homology modelling process. As a result, protein binding-site models of higher accuracy and relevance can be generated. Starting with the (crystal) structure of one or more template proteins, in the first step several preliminary homology models of the target protein are generated using the homology modelling program MODELLER. Ligands are then placed into these preliminary models using different strategies depending on the amount of experimental information about the binding mode of the ligands. (1.) If a ligand is known to bind to the target protein and the crystal structure of the protein-ligand complex with the related template protein is available, it can be assumed that the ligand binding modes are similar in the target and template protein. Accordingly, ligands are then transferred among these structures keeping their orientation as a restraint for the subsequent modelling process. (2.) If no complex crystal structure with the template is available, the ligand(s) can be placed into the template protein structure by docking, and the resulting orientation can then be used to restrain the following protein modelling process. Alternatively, (3.) in cases where knowledge about the binding mode cannot be inferred by the template protein, ligand docking is performed into an ensemble of homology models. The ligands are placed into a crude binding-site representation via docking into averaged property fields derived from knowledge-based potentials. Once the ligands are placed, a new set of homology models is generated. However, in this step, ligand information is considered as additional restraint in terms of the knowledge-based DrugScore protein-ligand atom pair potentials. Consulting a large ensemble of produced models exhibiting di erent side-chain rotamers for the binding-site residues, a composite picture is assembled considering the individually best scored rotamers with respect to the ligand. After a local force-field optimisation, the obtained binding-site models can be used for structure-based drug design

Allosterische Modulation an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren des Subtyps M₂ : Identifizierung essentieller Strukturelemente für Förderer der <i>N</i>-Methylscopolamin-Bindung vom Alkan-bisammonium-Typ

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren gehören zu den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und besitzen neben der orthosterischen Bindungsstelle für konventionelle Liganden wie Acetylcholin oder N-Methylscopolamin eine zweite, allosterische Bindungsstelle. Über diese können Muskarinrezeptoren aller fünf Subtypen allosterisch moduliert werden. Einen Prototyp-Modulator stellt die Alkan-bisammonium-Verbindung W84 [N,N'-Bis[3-(1,3-dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)propyl]-N,N,N',N'-tetramethyl-1,6-hexan-diammoniumdibromid] dar. Vorangegangene Untersuchungen ergaben, dass die Affinität von W84 zu Muskarinrezeptoren durch strukturelle Abwandlung dieser Verbindung deutlich gesteigert werden kann. Es gelang jedoch nicht, den hemmenden Einfluss von W84 auf die Bindung eines orthosterischen Liganden (negative Kooperativität) in eine allosterische Bindungsförderung (positive Kooperativität) zu überführen. In der vorliegenden Arbeit wurden neue Alkan-bisammonium-Verbindungen mit bisher nicht vorhandenen Strukturmodifikationen hinsichtlich ihres Potentials zur allosterischen Förderung der Ligandbindung an Muskarinrezeptoren untersucht. Die ausgewählten allosterischen Testsubstanzen wiesen eine Phthalimidopropyl-substituierte Hexan-bisammonium-Struktur auf, die durch symmetrische bzw. unsymmetrische Methylierung des Phthalimidringes und/ oder der Propylseitenkette variiert wurde. Es wurden Radioligandbindungsexperimente mit dem orthosterischen Liganden [3H]N-Methylscopolamin ([3H]NMS) an M2-Rezeptoren in Membransuspensionen aus Herzventrikelgewebe vom Hausschwein durchgeführt (Mg,Tris,Cl,Pi-Puffer: 3,6 mM MgHPO4 x 3 H2O, 50 mM Tris-HCl; pH 7,3; 37°C). In kinetischen Experimenten (Dissoziationsexperimente) wurde die allosterische Verzögerung der Dissoziation von [3H]NMS-Rezeptor-Komplexen untersucht. Der in diesen Experimenten ermittelte pEC0,5,diss-Wert diente als Maß für die Affinität des allosterischen Modulators zum Orthoster-besetzten Muskarinrezeptor. In Gleichgewichtsbindungsexperimenten wurden die Kenngröße pKA, die die Affinität des Modulators zum freien Rezeptor beschreibt, sowie der Kooperativitätsfaktor α der allosterischen Interaktion zwischen dem Modulator und dem orthosterischen Liganden [3H]NMS bestimmt. Aus diesen Experimenten wurde ferner die Kenngröße p(α KA) abgeleitet, die als Maß für die Affinität zum Orthoster-besetzten Rezeptor gilt. Erste orientierende Untersuchungen zeigten, dass einige methylierte Alkan-bisammonium-Verbindungen die Fähigkeit besitzen, die Gleichgewichtsbindung von [3H]NMS zu erhöhen. Ausgewählte, in den Positionen der Phthalimidgruppe und/ oder der Propylseitenkette systematisch unterschiedlich methylierte W84-Derivate wurden zur näheren Untersuchung der Struktur-Wirkungs-Beziehungen herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass positive Kooperativität zwischen den Modulatoren und [3H]NMS mit einer bevorzugten Steigerung der Affinität der Modulatoren zum Orthoster-besetzten M2-Rezeptor gegenüber einer schwächer ausgeprägten Zunahme der Affinität zum freien M2-Rezeptor einhergeht. Die Optimierung der Affinitäten der allosterischen Modulatoren zugunsten der Affinität zum Orthoster-besetzten M2-Rezeptor hängt dabei streng von der Position der Methylierung der betreffenden Verbindung ab. Die negative Kooperativität der nicht methylierten Ausgangsverbindung W84 mit [3H]NMS kann durch kombinierte Phthalimidring- und Seitenketten-Methylierung in nur einer Molekülhälfte des Modulators in positive Kooperativität umgewandelt werden. Eine unabdingbare Voraussetzung für positive Kooperativität scheint die Seitenketten-Methylierung zu sein, denn die alleinige Phthalimidring-Methylierung erhöht zwar die Affinität, lässt aber die negative Kooperativität unverändert. Eine zusätzliche Methylierung der anderen Molekülhälfte besitzt hinsichtlich der allosterischen Förderung der [3H]NMS-Gleichgewichtsbindung keinen zusätzlichen Effekt. Die Methylierung der anderen Molekülhälfte erhöht allerdings das Affinitätsniveau der Interaktion mit dem M2-Rezeptor. Als nächstes sollte die Frage geklärt werden, ob die mit [3H]NMS positiv bzw. neutral kooperativen methylierten Alkan-bisammonium-Verbindungen eine gegenüber dem negativ kooperativen Prototyp-Modulator W84 veränderte Abhängigkeit von essentiellen Rezeptorepitopen aufweisen. Diese Untersuchungen wurden an transient in COS 7-Zellen exprimierten humanen Wildtyp- bzw. mutierten Muskarinrezeptoren durchgeführt (Na,K,Pi-Puffer: 4 mM Na2HPO4, 1 mM KH2PO4; pH 7,4; 23°C). Der in einer Molekülhälfte Phthalimidring- und Seitenketten-methylierte allosterische Modulator, der in Experimenten an suinen M2-Rezeptoren in Mg,Tris,Cl,Pi-Puffer sowie in Na,K,Pi-Puffer positive Kooperativität mit [3H]NMS gezeigt hatte, erwies sich an den humanen M2-Rezeptoren in Na,K,Pi-Puffer als annähernd neutral kooperativ mit diesem orthosterischen Liganden. Das Kooperativitätsverhalten des methylierten Modulators war dementsprechend von der in beiden Puffersystemen beobachteten negativen Kooperativität zwischen dem Prototyp-Modulator W84 und [3H]NMS verschieden. In Dissoziationsexperimenten mit [3H]NMS an M2/M5-chimären sowie punktmutierten Muskarinrezeptoren konnte die Aminosäure M2177Tyrosin als das zweite (neben der aus vorangegangenen Untersuchungen bereits bekannten Aminosäure M2423Threonin) für die M2/M5-Selektivität der untersuchten Modulatoren essentielle Epitop identifiziert werden. Diese beiden Aminosäuren tragen alleine die M2/M5-Selektivität am Orthoster-besetzten Rezeptor sowohl der methylierten Verbindung als auch der Muttersubstanz W84. Nachfolgende Gleichgewichtsbindungsexperimente zeigten, dass die am M2-Wildtyp-Rezeptor beobachtete annähernd neutrale Kooperativität des methylierten allosterischen Modulators mit [3H]NMS durch Austausch des Aminosäure-Paares M2177Tyrosin und M2423Threonin gegen die korrespondierenden M5-Aminosäuren in negative Kooperativität umgewandelt wird. Dieser Befund verdeutlicht, dass dieses Aminosäure-Paar einen Einfluss auf die M2/M5-Selektivität der Kooperativität des methylierten Modulators mit [3H]NMS besitzt. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmalig gezeigt werden, dass allosterische Modulatoren vom Alkan-bisammonium-Typ die Gleichgewichtsbindung eines orthosterischen Liganden am muskarinischen M2-Rezeptor zu fördern vermögen, wenn sie das Strukturelement der Seitenketten-Methylierung enthalten. Diese Strukturvariation verändert jedoch nicht die Abhängigkeit von den beiden essentiellen Rezeptorepitopen, M2177Tyrosin und M2423Threonin. Aus der Interaktion mit diesen Epitopen kann anscheinend ein solcher Affinitätsgewinn gezogen werden, dass negative in positive Kooperativität übergeht

Allosteric Modulation of G Protein Coupled Receptors.

Structural coupling between the cytoplasmic (CP), transmembrane (TM) and extracellular (EC) domains of G protein coupled receptors (GPCRs) is crucial for their functioning in signal transfer from the extracellular to the intracellular side of the membrane. The focus of this thesis was to test the hypothesis that ligands can bind in each of the three domains. Depending on the location of the endogenous ligand binding site, the other two sites would become allosteric ligand binding sites. To test this hypothesis, we investigated the binding of accessory ligands to each of the three domains, CP, TM and EC. The major contributions of this thesis are as follows:I. The anthocyanin Cyanidin-3-glucoside (C3G) and the chlorophyll-derivative chlorin e6 (Ce6), were shown to physically interact with rhodopsin. These studies demonstrated the presence of a novel CP allosteric ligand binding site in rhodopsin. Biophysical evidence indicated differential effects of binding of these ligands on rhodopsin function, structure and dynamics. II. The allosteric TM ligand binding pocket in metabotropic glutamate receptors (mGluRs) was shown to be analogous in structure and function to the orthosteric TM retinal ligand binding pocket in rhodopsin. Docking of known allosteric modulators to structural models of mGluRs based on rhodopsin conformations was used to predict allosteric modulatory effects. Structural comparison of the mGluR and rhodopsin binding pockets revealed high overlap and preliminary evidence was obtained showing that an mGluR ligand can bind to rhodopsin.III. Evidence for the existence of an EC ligand binding domain was presented. Rhodopsin was shown to bind the extracellular chemokine ligand, CXCL11, an event which interfered with both rhodopsin and chemokine functions. IV. As part of the above efforts, it became necessary to develop and improve NMR spectroscopic methodology to study ligand binding of membrane proteins such as GPCRs. Thus, 1H and 19F based NMR methods to screen for novel ligands that bind to GPCRs were developed and applied to rhodopsin. Collectively, the studies presented in this thesis enhance the understanding of allosteric modulation of GPCRs in general, and of the molecular mechanism of rhodopsin and mGluR activation in the presence of allosteric ligands in particular. The results could help in the identification of new ligands to allosterically modulate receptor structures and in turn their functions at different binding pockets, thus paving new ways to selectively target this pharmacologically important class of receptors

Rezeptorepitop-Abhängigkeit der Bindung muskarinischer allosterischer Modulatoren unter verschiedenen ionalen Bedingungen

Muskarinische Acetylcholinrezeptoren gehören zur Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Es sind fünf verschiedene Subtypen von Muskarinrezeptoren bekannt, die alle neben der orthosterischen Bindungsstelle, an die der endogene Agonist Acetylcholin bindet, ein weiteres Bindungsareal besitzen, an das sich allosterische Modulatoren anlagern können. Dadurch kann die Rezeptorbindung orthosterischer Liganden moduliert werden. Viele allosterische Modulatoren weisen die höchste Affinität zum M2-Subtyp und die niedrigste zum M5-Subtyp auf. In Rezeptormutagenese-Studien waren zwei Aminosäuren identifiziert worden, die für die M2/M5-Subtypselektivität allosterischer Modulatoren wichtig sind: M2177Tyrosin und M2423Threonin. Das in allen fünf Subtypen konserviert vorliegende Epitop M2422Tryptophan war als wichtig für die subtypunabhängige Basisaffinität allosterischer Modulatoren beschrieben worden. Da die Experimente, die zur Entdeckung der genannten Epitope führten, unter den artifiziellen Inkubationsbedingungen eines 5 mM Na, K, Pi-Puffers worden waren und da die Bindungsaffinität vieler allosterischer Modulatoren eine ausgeprägte Pufferabhängigkeit aufweist, stellte sich die Frage, ob die genannten Epitope unter physiologischeren Pufferbedingungen weiterhin bindungsrelevant sind. Zur Untersuchung dieser Fragestellung wurden ein in seiner Wirksamkeit stark pufferabhängiger Modulator - Gallamin, ein mittelstark pufferabhängiger Modulator - die Alkan-bisammonium-Verbindung W84, und das wenig pufferabhängige Alcuronium sowie weitere Testsubstanzen untersucht. Rezeptorhaltige Membranhomogenate wurden von transient transfizierten COS-7-Zellen gewonnen. Neben dem 5 mM Na, K, Pi-Puffer (4 mMNaH2PO4 und 1 mMKH2PO4 bei 23°C) und dem 3/50 mM Mg-Tris-Puffer (3 mM MgHPO4 und 50 mM Tris-HCl bei 37°C) wurde ein Puffer bestehend aus 10 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 10 mM Hepes und 10 µM GDP bei 30°C ("10 mM Hepes-Puffer") eingesetzt. In Radioligandbindungsstudien wurde der radioaktiv markierte orthosterische Ligand [3H]N-Methylscopolamin ([3H]NMS) verwendet. Zur Ermittlung der Affinität allosterischer Modulatoren zum [3H]NMS-besetzten Rezeptor wurde in kinetischen Untersuchungen der pEC0.5,diss-Wert bestimmt, der das Ausmaß der dissoziationsverzögernden Wirksamkeit der allosterischen Substanzen quantifiziert. Die Affinität der allosterischen Substanzen zum freien Rezeptor, quantifiziert durch die Gleichgewichtsassoziationskonstante KA, und der Kooperativitätsfaktor a der Interaktion mit NMS wurden durch Gleichgewichtsbindungsuntersuchungen ermittelt. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Bedeutung der drei genannten Rezeptoreptope unter allen Inkubationsbedingungen weitgehend erhalten bleibt. Die Affinität allosterischer Modulatoren wird am unbesetzten und am NMS-besetzten Rezeptor aber in unterschiedlichem Ausmaß durch den Wechsel der Inkubationsmedien beeinflusst, somit kommt es unter verschiedenen Bedingungen zu leichten Änderungen des Ausmaßes der Kooperativität der allosterischen Modulatoren mit NMS. In fast allen Fällen wird lediglich die Quantität, also die Größe des Kooperativitätsfaktors, jedoch nicht die Richtung der kooperativen Interaktion, das heißt Bindungsförderung oder -senkung, verändert. Dies deutet darauf hin, dass die Topographie der Bindung allosterischer Modulatoren an muskarinischen Acetylcholinrezeptoren unter sehr verschiedenen Pufferbedingungen im Prinzip gleich bleibt, auch wenn sich die Bindungsaffinität der Modulatoren deutlich verändert