A Novel Gaussian Extrapolation Approach for 2D Gel Electrophoresis Saturated Protein Spots

Analysis of images obtained from two-dimensional gel electrophoresis (2D-GE) is a topic of utmost importance in bioinformatics research, since commercial and academic software available currently has proven to be neither completely effective nor fully automatic, often requiring manual revision and refinement of computer generated matches. In this work, we present an effective technique for the detection and the reconstruction of over-saturated protein spots. Firstly, the algorithm reveals overexposed areas, where spots may be truncated, and plateau regions caused by smeared and overlapping spots. Next, it reconstructs the correct distribution of pixel values in these overexposed areas and plateau regions, using a two-dimensional least-squares fitting based on a generalized Gaussian distribution. Pixel correction in saturated and smeared spots allows more accurate quantification, providing more reliable image analysis results. The method is validated for processing highly exposed 2D-GE images, comparing reconstructed spots with the corresponding non-saturated image, demonstrating that the algorithm enables correct spot quantificatio

A Novel Gaussian Extrapolation Approach for 2D Gel Electrophoresis Saturated Protein Spots

Analysis of images obtained from two-dimensional gel electrophoresis (2D-GE) is a topic of utmost importance in bioinformatics research, since commercial and academic software available currently has proven to be neither completely effective nor fully automatic, often requiring manual revision and refinement of computer generated matches. In this work, we present an effective technique for the detection and the reconstruction of over-saturated protein spots. Firstly, the algorithm reveals overexposed areas, where spots may be truncated, and plateau regions caused by smeared and overlapping spots. Next, it reconstructs the correct distribution of pixel values in these overexposed areas and plateau regions, using a two-dimensional least-squares fitting based on a generalized Gaussian distribution. Pixel correction in saturated and smeared spots allows more accurate quantification, providing more reliable image analysis results. The method is validated for processing highly exposed 2D-GE images, comparing reconstructed spots with the corresponding non-saturated image, demonstrating that the algorithm enables correct spot quantification

Using proteomic technologies to understand the impact of stress and nutritional factors on fish metabolism, welfare and quality

As the scale of aquacultural activities increases, we increasingly face challenges, not only in terms of sustainability, but also regarding issues like animal welfare and product quality. Within these research fields, proteomics (along with other -omics) is establishing itself as an invaluable tool for an untargeted assessment of the impact of exogenous stimuli on fish metabolism. This dissertation describes work developed in this area, where proteomic technologies were used to understand the impact of stress and nutritional factors on fish metabolism, welfare and quality. Gilthead seabream was chosen as the main biological model, due to its high importance in the Portuguese aquaculture sector, with Senegalese sole as secondary model. These studies were focused on both skeletal muscle and liver tissue. Results demonstrated that a reproducible proteomic analysis of the sarcoplasmic fraction of gilthead seabream muscle is feasible, with pre-slaughter stress inducing a clear hastening of the transition between the pre-rigor and post-rigor profiles. Comparatively, glycerol supplementation (as a tool to modulate muscle glycogen reserves) was shown to have a more subtle impact on the sarcoplasmic proteome of gilthead seabream, with results generally suggesting adaptive effects associated with this dietary factor. Hepatic proteome analyses revealed a high sensitivity towards both stress and dietary factors, with stress factors again displaying a broader impact on protein expression. In these experiments, the proteomic responses to sources of stress displayed specificities that depend on both the biological model and the type/duration of stressor, despite some degree of overlap in terms of the affected pathways. Concluding, despite the apparent resilience of gilthead seabream quality attributes in regards to nutritional and/or stress factors, proteome analysis revealed that these factors have an impact on both muscle and liver metabolism, being likely to affect post-mortem muscle degradation dynamics. The suggestion of specific candidates for further targeted studies underlines the usefulness of proteomics in this context.A aquacultura, apesar de se tratar de uma atividade humana que já conta com milénios de existência, entrou numa fase de crescimento surpreendente a partir da década de 60 do século passado, sendo que atualmente ultrapassa já o sector pesqueiro como principal fornecedor de produtos alimentares derivados de organismos aquáticos. Por outro lado, embora este crescimento prodigioso tenha acarretado mais-valias no que respeita ao custo e acessibilidade destes produtos alimentares (de elevada qualidade nutricional) às populações em geral, cada vez mais nos deparamos com diversos desafios, não só ao nível da sustentabilidade a longo-prazo destas atividades, como ao nível de questões relacionadas com o bem-estar animal e com a qualidade (nutricional e organolética) do produto final. Neste contexto, a proteómica (assim como a genómica, transcriptómica e metabolómica) tem-se estabelecido nos últimos anos como uma valiosa ferramenta na avaliação holística do impacto de fatores extrínsecos sobre os processos celulares dos peixes. O trabalho descrito nesta dissertação foca-se precisamente na aplicação de ferramentas proteómicas para o estudo do impacto do stress (a curto e a longo-prazo) no metabolismo dos peixes e processos de decomposição post-mortem (e, consequentemente, o seu efeito a nível do bem-estar dos peixes e da qualidade do produto final), assim como a interação de fatores nutricionais com estes fatores de stress. Para o efeito, procurou-se efetuar análises proteómicas ao nível de dois tecidos: por um lado, o músculo esquelético (i.e. o filete), dado que constitui a principal parte comestível do peixe; por outro, o fígado, que é o principal órgão responsável pelo controlo central dos processos metabólicos. Estes estudos foram realizados utilizando a dourada (Sparus aurata) como principal modelo animal, dada a sua importância no sector nacional de aquacultura. Para efeitos de comparação, foi ainda efetuado um estudo em linguado (Solea senegalensis), visto se tratar também de uma espécie relevante na aquacultura nacional e apresentar particular sensibilidade a fatores de stress, quando em cativeiro. No decorrer deste trabalho, foram realizados vários ensaios focados no tecido muscular da dourada, particularmente no que respeita a fatores imediatamente pre-mortem e o seu impacto nos processos de decomposição e, consequentemente, nas propriedades organoléticas do produto final. Os resultados obtidos confirmam a possibilidade de isolar a fração sarcoplasmática do proteoma muscular da dourada de forma reprodutível, dado que a sua aplicação aparentemente não aumenta a quantidade de ruído técnico inerente à análise do proteoma (Capítulo 2). A aplicação desta metodologia no estudo do stress pré-abate demonstrou um forte efeito deste tipo de stress pré-mortem no proteoma sarcoplasmático, claramente acelerando a transição entre um perfil pré-rigor e um perfil pós-rigor (Capítulo 3). Para além disso, apesar do impacto de fatores de stress sobre o proteoma muscular da dourada ser muito maior e mais abrangente do que o de fatores nutricionais, também se tornou claro que estes últimos (particularmente, o caso da suplementação alimentar com glicerol) podem induzir um efeito positivo ao nível das reservas de energia pré-mortem, podendo portanto constituir um fator mitigante no impacto dos efeitos de fatores de stress (Capítulo 4). Em relação aos ensaios focados na resposta proteómica do fígado face a fatores nutricionais e de stress, os resultados geralmente demonstram uma maior sensibilidade (comparado ao tecido muscular) face a estímulos externos, com os fatores de stress uma vez mais induzindo um maior impacto no proteoma comparativamente aos fatores nutricionais. Comparando os dois modelos animais utilizados (dourada e linguado), verificou-se que, apesar das semelhanças entre os dois modelos quando sujeitos a fatores de stress crónico em termos de vias metabólicas afetadas, existe uma fraca sobreposição em termos de proteínas especificamente afetadas, sugerindo a existência de idiossincrasias inerentes a cada espécie no que toca à sua resposta a fatores de stress (Capítulos 5 e 6). De facto, mesmo a aplicação de diferentes fatores de stress no mesmo modelo (dourada), em situações experimentais idênticas, demonstra a existência de uma dependência entre o tipo/duração do fator de stress aplicado e a resposta proteómica induzida, a nível hepático (Capítulo 5). Finalmente, conseguiu-se demonstrar que os dados obtidos por espectroscopia de infravermelho transmissiva do fígado de dourada fornecem importante informação que é tanto consistente como complementar à informação fornecida por metodologias proteómicas, providenciando um contributo significativo para o estudo do impacto do stress térmico sazonal no metabolismo da dourada, assim como para a formulação de dietas especiais fortificadas que providenciem um efeito positivo demonstrável no sentido de mitigar o impacto deste fator de stress (Capítulo 7). Concluindo, este trabalho demonstrou que tanto o stress crónico como o stress pré-abate induzem efeitos significativos a nível do proteoma muscular e hepático de peixes como a dourada e o linguado. É importante notar também que, em algumas das experiências, se demonstrou o potencial de fatores nutricionais na mitigação de alguns dos efeitos do stress induzido (tanto a nível hepático como a nível muscular). Para além disso, apesar da observação de claros efeitos induzidos por fatores nutricionais e de stress sobre o proteoma muscular, poucos efeitos foram notados em termos de impacto nas propriedades organoléticas do produto final (nomeadamente, textura, aroma e aspeto visual) que, apesar de positivo (dado ilustrar a robustez dos traços fenotípicos e propriedades organoléticas da dourada, face a fatores extrínsecos), torna difícil a utilização da dourada como modelo ótimo no estudo das relações entre o bem-estar animal e possíveis efeitos indesejados a nível da qualidade do produto final. Apesar disto, é inegável que estes fatores apresentam um impacto não-negligenciável sobre o bem-estar e o metabolismo dos peixes, facto atestado pelos resultados descritos nesta dissertação. Exemplos específicos de candidatos de estudo interessantes em futuros trabalhos nesta área incluem a proteína DJ-1, a proteína inibidora da Raf cinase (RKIP), a fosfohistidina fosfatase (PHP), entre outras proteínas regulatórias cuja expressão se demonstrou ser afetada por fatores nutricionais e de stress. Tudo isto demonstra a utilidade da proteómica no contexto da aquacultura, particularmente na área do bem-estar animal, como uma ferramenta sensível na deteção de sinais de stress fisiológico/celular e desvios metabólicos, mesmo quando estes não são aparentes mediante o recurso a técnicas clássicas.Universidade do Algarve, Faculdade de Ciências e Tecnologi

Quantitative pharmacoproteomics investigation of anti-cancer drugs in mouse. Development and optimisation of proteomics workflows for evaluating the effect of anti-cancer drugs on mouse liver

Minimizing anti-cancer drug toxicity is a major challenge for the pharmaceutical industry. Toxicity is most frequently due to either the direct interaction of the drug on previously unidentified targets or its conversion to metabolites by drug metabolizing enzymes (e.g. CYP450 enzymes) that cause cellular, tissue or organ damage. Pharmacoproteomics is beginning to take a central role in studying changes in protein expression corresponding to drug administration, the results of which, inform about the mode of action, toxicity, and resistance in pre-clinical and clinical stages of drug development. The main aim of this research is to apply comparative proteomics studies on livers from male and female mice xenograft models treated with major anti-cancer drugs (5-flourouracil, paclitaxel, cisplatin, and doxorubicin) and CYP inducer, TCPOBOP, to investigate their effect on protein expression profiles (proteome). Within this thesis, an attention is paid to optimise a highly validated proteomics workflow for biomarker identification. Proteins were extracted from liver microsomes of mice treated in two separate sets; Set A – male (5-fluoruracil, doxorubicin, cisplatin and untreated) or Set B – female (5-fluoruracil, paclitaxel, TCPOBOP and untreated) using cryo-pulverization and sonication method. The extracts were digested with trypsin ii and the resulting peptides labelled with 4-plex iTRAQ reagents. The labelled peptides were subjected for separation in two-dimensions by iso-electric focusing (IEF) and RP-HPLC techniques before analysis by mass spectrometry and database searching for protein identification. Set A and Set B resulted in identification and quantification of 1146 and 1743 proteins, respectively. Moreover, Set A and Set B recovered 26 and 34 cytochrome P450 isoforms, respectively. The microsomal changes after drug treatments were quite similar. However, more changes were observed in the male set. Up-regulation of MUPs showed the greatest distinction in the protein expression patterns in the treated samples comparing to the untreated controls. In Set A, 5-fluoruracil and cisplatin increased the expression of three isoforms (MUP1, 2, and 6), whereas doxorubicin has increased the expression of four isoforms (MUP1, 2, 3, and 6). On the other side, only TCPOBOP in Set B has increased the expression of two isoforms (MUP1 and 6). Our findings showed that the expression of MUP, normally involved in binding and excretion of pheromones, have drug- and sex-specific differences. The mechanism and significance of MUP up-regulation are ambiguous. Therefore, the impact of each therapeutic agent on MUP and xenobiotic enzymes will be discussed