Generation of a polymimotope vaccine against malignant melanoma

“Peptidmimics” von konformationellen Epitopen eines Tumorantigens werden auch als Mimotope bezeichnet und stellen vielversprechende Kandidaten für die Entwicklung von Tumorvakzinen dar. Derartige Mimotopvakzine induzieren eine Tumorantigen-spezifische Immunantwort. Kürzlich konnte für das maligne Melanom gezeigt werden, dass durch Vakzinierung von Kaninchen mit einem an Tetanustoxoid gekoppelten Mimotop des HMW-MAA (“high molecular weight-melanoma associated antigen”) Antikörper gebildet wurden, die das Tumorwachstum in einem Melanommausmodell hemmen konnten. HMW-MAA wurde als Zielantigen gewählt, da es von vielen Melanomzellen exprimiert wird und in normalen Geweben fast nicht vorkommt. Das Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung einer Polymimotopvakzine, die eine starke humorale Immunantwort gegen mehrere Epitope des HMW-MAA induzieren sollte. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass Vakzine, die gegen mehr als ein Epitop eines Tumorantigens gerichtet sind, eine höhere Erfolgsrate aufweisen. Der Effekt der induzierten Antikörper sollte sowohl in vitro (Tumorproliferation, antikörperabhängige, zellvermitteltete Zytotoxizität, komplementabhängige Zyto-toxizität) als auch in vivo (Melanommausmodell: C57BL/6 Mäuse mit einem subkutanen Tumor der HMW-MAA transfizierten Mausmelanomzelllinie B16F10) untersucht werden. Mittels einer linearen pIII-12mer Phagenpeptidbank wurden Peptidliganden für eine Reihe von anti-HMW-MAA monoklonalen Antikörpern (mAbs VT80.12, VF1-TP43, VF1-TP34, 149.53 und 225.28S F(ab')2) selektiert. Diese Antikörper erkennen unterschiedliche Epitope des HMW-MAA, weshalb sie sich gegenseitig in ihrer Bindung nicht inhibieren. Es wurden verschiedene Panningstrategien angewendet (Panning mit Oberflächenimmobilisierung und in Lösung mit Protein G- bzw. Streptavidin-Bindung). Für jeden mAb wurde mindestens ein Peptidligand identifiziert. Es waren aber nur die Peptide, die für die mAbs VT80.12 und VF1-TP43 identifiziert wurden, auch in der Lage, die Bindung der entsprechenden mAbs an das HMW-MAA zu inhibieren. Daher wurden diese beiden Peptide jeweils an KLH („keyhole limpet hemocyanin“) als immunogenen Träger gekoppelt. Die in Kaninchen induzierten Antikörper zeigten einen starken Hintergrund verursacht durch die anti-KLH Antikörper. Durch die Immunisierung von BALB/c Mäusen konnte dieses Problem gelöst werden. Beide Peptide induzierten Peptid-spezifische Antikörper, aber nur das VT80.12-Peptid induzierte auch anti-HMW-MAA Antikörper. Diese Antikörper waren jedoch nicht in der Lage, das Wachstum der HMW-MAA exprimierenden humanen Melanomzelllinie 518A2 in vitro zu inhibieren. In dieser Arbeit konnten sehr viele neue Informationen für die Selektion von Mimotopen gewonnen werden, jedoch konnten noch keine idealen Mimotopkandidaten für die Polymimotopvakzine identifiziert und im Melanommausmodell getestet werden.Peptide mimics, also called mimotopes, of conformational epitopes of tumor antigens are promising candidates for the design of anti-tumor vaccines. Such mimotope vaccines stimulate a tumor antigen specific immune response. For melanoma, it was recently demonstrated that vaccination of rabbits with a mimotope of the high molecular weight-melanoma associated antigen (HMW-MAA) coupled to tetanus toxoid induced antibodies that suppressed tumor growth in a melanoma xenotransplant severe combined immunodeficiency mouse model. The HMW-MAA was selected as target antigen because it is highly expressed on melanoma cells and has a restricted distribution in normal tissues. The aim of this thesis was to develop a polymimotope vaccine that would induce a strong humoral immune response against several epitopes of the HMW-MAA. Several studies have demonstrated that vaccines directed against multiple epitopes of a tumor antigen have a higher success rate. The effect of the induced antibodies were then to be tested in vitro (tumor proliferation, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, complement-dependent cytotoxicity) and in vivo (melanoma mouse model: C57BL/6 mice harboring a subcutaneous tumor of the mouse melanoma cell line B16F10 transfected with the HMW-MAA). Peptide ligands for a panel of anti-HMW-MAA monoclonal antibodies (mAbs) – VT80.12, VF1-TP43, VF1-TP34, 149.53, and 225.28S F(ab')2 – which recognize distinct epitopes on the HMW-MAA and do not cross-inhibit each other were selected using a linear pIII-12mer phage display peptide library by surface panning as well as solution-phase panning with protein G or streptavidin capture. Peptide ligands were identified for each mAb, but only one peptide identified for each of the mAbs VT80.12 and VF1-TP43 was able to inhibit the binding of the respective mAb to the HMW-MAA. These two peptides were then coupled to keyhole limpet hemocyanin (KLH) as immunogenic carrier and used for immunization of rabbits. Due to the high background of the KLH-induced antibodies, further immunizations were performed in BALB/c mice. Both peptides induced a peptide specific immune response but only the VT80.12-peptide induced anti-HMW-MAA antibodies. However, these antibodies did not suppress the proliferation of the HMW-MAA expressing human melanoma cell line 518A2 in vitro. In summary, we have produced a lot of new methodologic know-how on the selection of mimotopes but could not yet identify ideal mimotope candidates which could be tested as parts of a polymimotope vaccine in the melanoma mouse model

Immune responses to cow's milk allergens

Kuhmilchallergie ist die am häufigsten auftretende Lebensmittelallergie innerhalb der ersten Lebensjahre und betrifft ungefähr 2-3% aller Säuglinge und Kleinkinder in Industrieländern. Die meisten Patienten mit Kuhmilchallergie leiden unter Symptomen, die mehr als ein Organ betreffen, wie zum Beispiel kutane, gastrointestinale und respiratorische Symptome und im schlimmsten Fall lebensbedrohliche anaphylaktische Reaktionen. Ungefähr 60% aller allergischen Reaktionen auf Kuhmilch sind IgE-vermittelt und ungefähr 40% sind nicht-IgE-vermittelt. Die Mechanismen bei nicht-IgE-vermittelten Unverträglichkeiten sind nicht genau bekannt und können andere Immunglobuline und/oder zell-vermittelte Wirkungsweisen umfassen. Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der Isolierung von cDNAs, die für Hauptallergene in der Kuhmilch kodieren, sowie in der Expression dieser Allergene in rekombinanter Form in Escherichia coli. Dabei wurden zwei Milchproteine, Alpha-Laktalbumin aus der Molkefraktion und AlphaS1-Kasein aus der Kaseinfraktion im Detail charakterisiert. Beide Allergene wurden hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften mittels SDS-PAGE, Zirkulardichroismus und Massenspektrometrie analysiert. Ihre IgE Reaktivität wurde durch Immunblotting und ELISA gezeigt und ihre biologische Aktivität durch Degranulation von basophilen Granulozyten bestätigt. Durch die Anwendung von synthetischen Peptiden wurden lineare Epitope auf beiden Allergenen gefunden und es konnte das Vorhandensein von Konformationsepitopen nachgewiesen werden. Diese beiden rekombinanten Allergene können nun für eine Komponenten-spezifische Diagnostik bei Patienten mit Kuhmilchallergie verwendet werden. Weiters wurden die IgE-reaktiven und biologisch aktiven Allergene zur Entwicklung eines neuen Diagnosesystems verwendet, das aus einem Allergen-Mikroarray und einem Test zur Bestimmung von Mediatorenfreisetzung besteht. Die Mikroarray-Technologie erlaubt die Austestung von vielen verschiedenen Allergenen auf einmal, dies stellt vor allem bei dem Vorhandensein von kleinen Serummengen bei Säuglingen und Kleinkindern einen großen Vorteil dar. Die Kombination mit einem biologischen Test ermöglicht es, Patienten mit Risiko für starke systemische Reaktionen zu identifizieren. Dies ist sinnvoll bei starken Kuhmilchallergikern, die beim Durchführen von in vivo Tests wie Provokationstests an starken Reaktionen leiden könnten. Ein anderer Scherpunkt dieser Dissertation liegt in der Untersuchung von immunologischen Mechanismen, die durch eventuell nicht-IgE-vermittelte Reaktionen nach Konsum von Kuhmilch auftreten können. Die Bestimmung von IgG1-4 Subklassen und IgA Antikörpern gegen gereinigte rekombinante Proteine zeigte, dass Patienten mit nicht-IgE-vermittelter Kuhmilchunverträglichkeit basierend auf der humoralen Immunantwort auf Kuhmilchantigene nicht von Personen ohne Kuhmilchintoleranz unterschieden werden können. Wir sind deshalb zu dem Schluss gekommen, dass andere Antikörper als IgE geringen Einfluss auf Kuhmilchunverträglichkeiten haben. Zusammenfassend war es möglich, innerhalb dieser Dissertation Hilfsmittel zu entwickeln, die bei der Komponenten-spezifischen Diagnostik von IgE-vermittelter und nicht-IgE-vermittelter Kuhmilchallergie eingesetzt werden können. Dadurch erhält man wertvolle Informationen, die in Zukunft bei der Entwicklung von Strategien zur Behandlung von Kuhmilchallergie verwendet werden können.Cow’s milk allergy is the most prevalent food allergy in the first years of life, affecting about 2 to 3% of infants and young children in developed countries. Most cow’s milk allergic patients suffer from symptoms in more than one organ system showing cutaneous, gastrointestinal, respiratory symptoms, and in the worst case anaphylactic reactions. Around 60% of all allergic reactions to cow’s milk are IgE-mediated and around 40% are non-IgE-mediated. The mechanisms of the later might involve other immunoglobulins, immune complexes, and/ or cell-mediated mechanisms. The main aim of this thesis was the isolation of cDNAs coding for major cow’s milk allergens and the expression of these allergens in a recombinant form in Escherichia coli. The focus was on two milk proteins, alpha-lactalbumin, deriving from the whey fraction, and alphaS1-casein, deriving from the casein fraction. Both allergens were biochemically characterized using SDS-PAGE, circular dichroism analysis, and mass spectrometry. Their IgE reactivity was demonstrated by immunoblotting and ELISA and their allergenic activity was proven using rat basophil leukaemia cells transfected with the human FcεRI. Using synthetic peptides I could map sequential IgE-epitopes on the two allergens and I was able to show in case of both allergens also the presence of conformational IgE epitopes. These two recombinant allergens can be used for component resolved diagnosis of patients suffering from cow’s milk allergy. I further utilized the IgE-reactive and biologically active allergens for the development of a novel diagnostic system, consisting of an allergen microarray and a mediator release assay. The microarray technology has the advantage that a large panel of allergens can be evaluated in parallel especially when only small samples of serum are available as for infants and children. The combination with a biological assay allows identifying cow’s milk allergic patients that suffer from severe systemic reactions. This diagnostic system might therefore represent a useful diagnostic tool for highly allergic cow’s milk allergic patients where in vivo tests can not be applied because of the risk of allergic reactions. Another part of my thesis was focused on the investigation of immunological mechanisms involved in non-IgE-mediated cow’s milk allergic reactions. Determination of IgG1-4 subclass and IgA antibody levels to purified recombinant allergens showed that based on their humoral immune response to cow’s milk antigens, persons suffering from non-IgE-mediated cow’s milk intolerance can not be discriminated from persons without cow’s milk intolerance. We therefore concluded that antibody-mediated forms of hypersensitivity against cow’s milk allergens, besides those mediated by IgE, play no or only a minor role in cow’s milk intolerance. In summary, I was able to develop tools for component resolved diagnosis of IgE-mediated and non-IgE-mediated cow’s milk allergy and to gain information that might in the future lead to the design of new strategies for treatment of cow’s milk allergy

Feasibility studies for development of specific re-loadable binding sites for drug delivery systems immobilized onto implant surfaces

Ziel dieser Dissertation war die Entwicklung eines neuartigen biokompatiblen Beschichtungssystems für medizinische Implantatmaterialien, die Bindungsstellen für bioabbaubare, mit Wirkstoffen beladene Nanopartikel (Drug Carriers) tragen. Diese Wirkstoffe werden während des Abbaus der Drug Carriers dort kontrolliert freigesetzt. Nach dem Abbau der Partikel sind diese Bindungsstellen wieder frei um mit neuen Drug-Carriers beladen zu werden. Zum Erreichen dieses Ziels wurden als Testsystem die Implantatmaterialien Edelstahl und Zirkon-Keramik verwendet. Zur Verbesserung der Biokompatibilität wurde ein sogenanntes Passivcoating mit Polymeren wie z.B. dem medizinisch zugelassenen Polyethylenglykol (PEG) aufgebracht, um eine Schutzschicht zu bilden. Außerdem wurde ein geeignetes Rezeptorsystem zu verankert, das in der Lage ist, biodegradable mit Wirkstoffen beladene Mikro- oder Nanopartikel (Drug Carriers) zu binden, um eine lokale pharmakologische Wirkung zu erzielen (Aktives Coating). Zu diesem Zweck wurden spezielle Antikörper bzw. auch Antikörper-Fragmente als Capture-Moleküle an die Oberfläche des Implantatmaterials gebunden. Zur Herstellung der Drug Carriers wurden sowohl ein Copolymer aus Milch- und Glycolsäure (PLGA) als auch Chitosan verwendet. Die Drug Carriers werden dann entweder durch Hydrolyse oder mit Hilfe von Enzymen im Blut (Hydrolyse für PLGA, Lysozym für Chitosan) abgebaut und setzten die in ihnen enthaltenen Wirkstoffe lokal frei. Nach dem vollständigen Bioabbau liegen die Capture-Moleküle wieder frei vor und können mit neuen Drug Carriers beladen werden, womit ein vollkommen neuartiges System für Wirkstoffabgabe von medizinischen Implantaten zur Verfügung steht. Solche Beschichtungen können die Basis für eine Vielzahl von Anwendungen sein, die eine gezielte Wirkstoffabgabe an der Grenzfläche zwischen Implantat und gesundem Gewebe erfordern. Bei Bedarf können die Drug Carriers in die Blutbahn injiziert werden, binden an das Rezeptorsystem auf der Implantatoberfläche und setzen im Zuge ihres Abbaus die Wirkstoffe frei. Da sie mit unterschiedlichen Wirkstoffen beladen werden können, ermöglichen sie eine patientenspezifische Anpassung der Medikation, aber auch die Gabe von Wirkstoffen, die sonst zu rasch abbaubar oder schwierig zu dosieren wären. Der analytische Nachweis des erfolgreichen chemischen Setups mit Hilfe optischer Methoden erwies sich als schwierig auf Grund von Quenching Effekten im Fall von Metall bzw. wegen der rauen Oberfläche bei Zirkon (Keramik). Daher wurde die spezifische Bindung der Nanopartikel an der Implantatoberfläche an Glasoberflächen mit gleicher chemischer Beschichtung mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie getestet. Außerdem mussten für den Nachweis des erfolgreichen chemischen Aufbaus und der biorecognitiven Bindung verschiedene neue analytische Tests entwickelt und evaluiert werden. Ein schwieriges Problem, das in dieser Arbeit gelöst werden musste, war das Finden eines brauchbaren Biorekognitionssystems für das Binden der biokompatiblen Drug Carrier Nanopartikel. Es braucht spezielle Lösungsansätze, um Antikörperbildung gegen biokompatible Materialien zu induzieren. Im Fall von Chitosan, waren Antikörper kommerziell erhältlich, während für PLGA ein sehr stringentes Immunisierungsprotokoll in Kaninchen entwickelt werden und auch Probleme hinsichtlich Reinigung und Titerbestimmung gelöst werden mussten. Durch die durchgeführten Experimente war es möglich ein „Proof of concept“ für ein wiederbeladbares Targeting-system zur lokalen Medikamentenfreisetzung an Oberflächen zu geben. Dieses neuartige System ist eine Basis für ein breites Anwendungsgebiet in der regenerativen Medizin wie z.B. Stents, artifizielle Knochenimplantate und andere künstliche Gewebe, die eine lokale und kontrollierte Medikamentenfreisetzung an der Grenzfläche zwischen Implantat und gesundem Gewebe benötigen. Das Drug-Delivery System schützt die eingeschlossenen Wirkstoffe vor vorzeitigem Abbau – wichtig z.B. bei Wachstumsfaktoren und Immunsuppressiva und erleichtert auch den Transport von schwer absorbierbaren oder schwer löslichen Wirkstoffen zum erwünschten Wirkort. Dank der hohen lokalen Wirkstoffkonzentration wird die Absorption schwerlöslicher Substanzen verbessert, wodurch unerwünschte systemische Nebenwirkungen vermindert werden können.The overall objective of this thesis is to develop novel, bio-compatible coatings for medical implant materials with binding sites for bio-degradable nanoparticles that may serve as drug carriers. The drugs are released gradually during decomposition and after particle degradation the binding sites can be reloaded with new drug delivering particles. To achieve this goal, we used stainless-steel and zirconia as test implant materials. To improve biocompatibility of these materials a so called “passive coating” procedure is used where biocompatible polymers such as polyethyleneglycol (PEG) act as a barrier. Furthermore a specific receptor system was introduced for binding drug containing biodegradable nano- or micro-particles to mediate local pharmacological activity, the so called active coating. For this purpose specific antibodies or antibody-fragments were generated and coupled to the implant material surface as capture molecules for the drug releasing particles. Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) and chitosan were used to produce these biodegradable nanoparticles. The particles are then degraded either by hydrolysis or by means of enzymes circulating in the bloodstream (mere hydrolysis for PLGA and lysozyme for chitosan) while releasing the drugs locally. After complete biodegradation the receptor system is then free again for reloading with new particles containing the respective drugs, making this a completely new mean of drug administration on medical implants. Such coatings can be the basis for a number of applications that require controlled, local drug delivery at the interface between an implant and healthy tissue. Upon the need for medication, drug-loaded nanoparticles can be injected into the bloodstream, bind to the particle-specific antibodies on the target implant and gradually release their drug content during degradation. As nanoparticles can be loaded with different drugs, this technology allows easy adjustment to patient-specific medication needs as well as the administration of compounds that are easily degradable or difficult to dose. Analytical proofs of principle on these materials have proved to be difficult, as the currently available optical methods for testing the successful chemical setup could not be applied because of quenching effects on metal surfaces and the rough surface of zirconia (ceramics). Therefore specific binding of the nanoparticles onto the implant surface was tested on glass substrates, coated similarly as the implant materials, by means of fluorescence microscopy. Furthermore for proof of the successful chemical setup and biorecognitive binding several new analytical test methods had to be developed and evaluated. One of the major challenges we had to overcome was to find suitable biorecognitive systems for binding of the drug containing particles, as these have to be biocompatible too. Special efforts were made to identify and generate specific antibodies against biocompatible materials. In case of chitosan, antibodies were commercially available, whereas for PLGA a very stringent immunisation protocol had to be developed for antibody production in rabbits, in addition to optimization of the purification and titer determination protocols. Using these tools, we were able to perform specific experiments that demonstrate a proof of concept for the possibility to generate a reloadable targeting device for local drug release and potential of our approach in targeted drug delivery and release. This new system provides the basis for a wide array of applications in regenerative medicine such as stents, implants of artificial bones and other artificial tissues, requiring local drug action at the interface between an implant and healthy tissue in a controlled manner. The delivery system protects the incorporated drugs from degradation prior to action e.g. growth factors and immunosuppressives, and facilitates the transport of poorly absorbable or insoluble drug candidates to the intended site of action. Due to the high local drug concentration, the absorption rate of poorly soluble drug molecules will be improved, which would significantly reduce undesired, adverse systemic effects. Furthermore after implantation also a change of drugs is possible, as with each reloading procedure appropriate drugs according to patients needs may be chosen

Digitale Infrastrukturen für die germanistische Forschung

Modern research in linguistics is increasingly reliant on digital infrastructure and information systems. This development began at the turn of the millennium and has since accelerated. The volume examines national and European infrastructure networks and the range of language resources in German linguistics that can be discovered, disclosed, and re-applied through digital infrastructure

IMMUNOLOGY IN CROATIA 40th anniversary of the Croatian Immunological Society

This special issue is dedicated to the 40th Anniversary of organized activities of the Croatian Immunological Society. On this occasion the Annual Meeting of Croatian Immunological Society will be organized in [ibenik, October 9-12 2008, where this supplement will be introduced and distributed. The idea for such a collection of data was born (conceived) during my first presidency 10 years ago, when the first account of Croatian Immunological Society activities was published, in Croatian. This time, we have tried to include not only the founding and activities of Croatian Immunological Society but also all research groups working in the field of immunology in Croatia during the past 40 years. I wish to express my warmest thanks to all authors for their contributions. Especially for collecting all the relevant data, references and achievements of their research groups. From the collected data it is evident that Immunology in Croatia developed very fast (rapidly), and achieved a prominent place among scientific disciplines. Both national and international collaboration resulted in the establishment of new groups, not only at universities where immunology first started, but also at several institutes and hospitals in Zagreb and Rijeka. The number of Croatian Immunological Society members varies, being always more than one hundred and less than two hundred, but with a very good renewal rate of young members each year. We hope that, with improved financing policy of basic science in Croatia, more novices will be attracted, and that immunologists will remain as active as they were throughout this past 40 years, despite some quite untoward conditions. Sabina Rabatić guest edito

CLARIN. The infrastructure for language resources

CLARIN, the "Common Language Resources and Technology Infrastructure", has established itself as a major player in the field of research infrastructures for the humanities. This volume provides a comprehensive overview of the organization, its members, its goals and its functioning, as well as of the tools and resources hosted by the infrastructure. The many contributors representing various fields, from computer science to law to psychology, analyse a wide range of topics, such as the technology behind the CLARIN infrastructure, the use of CLARIN resources in diverse research projects, the achievements of selected national CLARIN consortia, and the challenges that CLARIN has faced and will face in the future. The book will be published in 2022, 10 years after the establishment of CLARIN as a European Research Infrastructure Consortium by the European Commission (Decision 2012/136/EU)

CLARIN

The book provides a comprehensive overview of the Common Language Resources and Technology Infrastructure – CLARIN – for the humanities. It covers a broad range of CLARIN language resources and services, its underlying technological infrastructure, the achievements of national consortia, and challenges that CLARIN will tackle in the future. The book is published 10 years after establishing CLARIN as an Europ. Research Infrastructure Consortium

The effect of local or systemic tumor necrosis factor (TNF)-α inhibition on the immune response in experimental autoimmune uveoretinitis

In der hier vorliegenden experimentellen Arbeit wurde untersucht, inwieweit die lokale Inhibition von TNF-α den Verlauf der EAU als Modell für die humane endogene posteriore Uveitis verbessern kann und Einfluss auf zugrunde liegende immunologische Prozesse nimmt. Der durchgeführte TNF-α-Bioassay an L929-Zellen zeigte, dass der dabei eingesetzte humanisierte Wirkstoff Etanercept die biologische Aktivität auch von murinem TNF-α in vitro effektiv hemmen kann. Um zu überprüfen, ob Etanercept generell auch einen mildernden Einfluss auf den EAU-Verlauf hat, wurde der Wirkstoff zunächst systemisch angewendet. Dabei zeigte sich, dass der EAU-Schweregrad durch die systemische Behandlung mit Etanercept in der afferenten Phase des Modells signifikant verringert war. Dieser reduzierte EAU-Schweregrad in der Etanercept-Behandlungsgruppe war von einer verringerten antigenspezifischen Proliferation von Milzzellen und einer reduzierten antigenspezifischen Produktion von proinflammatorischen Th1-, Th2- sowie Th17-assoziierten Zytokinen durch Milzzellen begleitet. Die systemische Behandlung mit Etanercept in der efferenten Phase des Modells zeigte hingegen keinen reduzierenden Einfluss auf den EAU-Schweregrad sowie die antigenspezifische Proliferation von Milzzellen. Dies galt auch für die systemische Etanercept-Behandlung in dem EAU-Modell, das durch den adoptiven Transfer von IRBPp161-180-spezifischen und in vitro restimulierten Splenozyten induziert wurde. Die Ergebnisse zur systemischen TNF-α-Inhibition durch Etanercept signalisierten damit eine bedeutende Rolle von TNF-α in der Induktionsphase der EAU. Es kann gefolgert werden, dass Etanercept in erster Linie Einfluss auf die Generierung von uveitogenen Effektorzellen nimmt, nicht aber auf bereits aktivierte und differenzierte Effektorzellen wirkt. Zur lokalen Behandlung der EAU wurden intravitreale oder subkonjunktivale Wirkstoffapplikationen angewendet. Auch nach intravitrealen Injektionen von Etanercept in der afferenten Phase des Modells war der EAU-Schweregrad im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant geringer. Dabei ging die Reduktion des EAU-Schweregrades jedoch nicht mit einer verringerten antigenpezifischen Proliferation von Milzzellen einher. Bezüglich der antigenspezifischen Produktion von Zytokinen durch Milzzellen wurde nach der intravitrealen Etanercept-Applikation eine Reduktion des zentralen Th1-Zytokins IFN-γ beobachtet, während die Th2-assoziierten Zytokine IL-6 und IL-10 erhöht waren. Diese Ergebnisse sprechen für unterschiedliche Wirkmechanismen von Etanercept in Abhängigkeit der Applikationsroute. Der Wirkmechanismus der systemischen Etanercept-Applikation bestand eher in der allgemeinen Suppression der Generierung proinflammatorischer Effektorfunktionen, während die Ergebnisse zur intravitrealen Etanercept-Applikation eher einen immunmodulatorischen Wirkmechanismus aufzeigten. Die subkonjunktivale Etanercept-Injektion als weiterer lokaler Behandlungsansatz zeigte keinen verringernden Effekt auf den EAU-Schweregrad. Als Wirkstoffkontrolle zu Etanercept wurden gegen die mRNA von TNF-α gerichtete ASON eingesetzt. Es konnte jedoch kein verbessernder Einfluss auf den EAU-Verlauf nach lokaler Applikation beobachtet werden. Schlussendlich war die systemische Applikation von Etanercept effektiver zur Behandlung der EAU als die intravitreale Applikation. In diesem Zusammenhang wiesen die Experimente zur VCAID-Induktion in der hier vorliegenden Arbeit auf eine Beeinträchtigung des Immunprivilegs des Auges durch die intraokulare TNF-α-Inhibition mit Etanercept hin. Solche Einflüsse auf regulatorische Funktionen von TNF-α könnten damit einen limitierenden Faktor für den Wert der intravitrealen Etanercept-Applikation als lokalen Behandlungsansatz für eine autoimmune posteriore Uveitis darstellen.In the present experimental study the extent was determined to which local TNF-α inhibition ameliorates the course of an animal model of human posterior uveitis (experimental autoimmune uveoretinitis [EAU]) and it was investigated how this affects underlying immunopathological processes. In these experiments etanercept functioned as an antagonist to block TNF-α. A TNF-α bioassay with L929 cells showed that etanercept effectively inhibits the biological activity of murine TNF-α in vitro. The effect of etanercept on the course of EAU was initially analyzed by treating immunized mice systemically in the afferent phase. Here, EAU scores were significantly lower in the etanercept group, which was also accompanied by decreased antigen-specific proliferation of splenocytes. Furthermore, systemic etanercept treatment in the afferent phase lowered the antigen-specific production of various proinflammatory cytokines by splenocytes. In contrast, systemic etanercept treatment in the efferent phase had no reducing effect on EAU severity, nor did it decrease the antigen-specific proliferation of splenocytes as compared to control mice. This was also observed after systemic etanercept treatment of animals in which EAU was induced by adoptive transfer of uveitogenic splenocytes. These results for the systemic TNF-α inhibition by etanercept indicate that TNF-α has a predominant role in the immunopathologic processes of the induction phase of EAU, suggesting that etanercept affects the generation of uveitogenic effector cells rather than having an effect on already activated and differentiated effector cells. For local treatment, etanercept was injected intravitreally or subconjunctivally. After intravitreal etanercept treatment in the afferent phase, EAU scores were also significantly lower than those in the control group. However, the improved EAU scores were not associated with reduced antigen-specific proliferation of splenocytes. Regarding the antigen-specific cytokine response of splenocytes, the Th1 cytokine IFN-γ was reduced after intravitreal etanercept treatment, while the Th2 associated cytokines IL-6 and IL-10 were elevated. These results indicate that the mechanism of action may be different for systemic and intravitreal etanercept treatment. While systemic TNF-α inhibition using etanercept in the afferent phase suppressed proinflammatory effector functions, the mechanism underlying EAU improvement after intravitreal TNF-α inhibition seemed to be immunomodulation. The subconjunctival injection of etanercept as a further local treatment approach showed no ameliorating effect on the course of EAU at any time in this model. In further experiments, ASON binding to the mRNA of TNF-α were used as a drug control to etanercept. Independently of the applied treatment schedule, local ASON treatment had no ameliorating effect on the course of EAU. Finally, systemic administration of etanercept more effectively ameliorated EAU than intravitreal administration. In this context, the experiments concerning the induction of VCAID shown here indicate that intraocular TNF-α inhibition using etanercept impairs immune privilege of the eye. Interfering with such regulatory functions of local TNF-α may limit the value of intravitreal etanercept treatment for autoimmune posterior uveitis

CLARIN

The book provides a comprehensive overview of the Common Language Resources and Technology Infrastructure – CLARIN – for the humanities. It covers a broad range of CLARIN language resources and services, its underlying technological infrastructure, the achievements of national consortia, and challenges that CLARIN will tackle in the future. The book is published 10 years after establishing CLARIN as an Europ. Research Infrastructure Consortium