Caractérisation du rôle de la protéine homéotique BP1, dans la régulation des gènes adultes de B[bêta] globine

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Caractérisation du rôle de la protéine homéotique BP1, dans la régulation des gènes adultes de B[bêta] globine

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mécanismes de régulation de la balance prolifération/différenciation érythroïde par les facteurs de transcription GATA-1, FOG-1, E2F et la voie de signalisation Akt

With more than 100 billion red blood cells generated every day, the erythroid lineage has the largest output of cell production in adult mammals. This production requires a tight balance between cell proliferation, mainly controlled by erythropoietin (Epo)/PI3K/Akt signaling pathway, and erythroid differentiation induced by GATA-1 and FOG-1 transcription factors. Various links between these two processes have been previously demonstrated in the laboratory: 1) Epo-activated Akt directly phosphorylates GATA-1 transcription factors, and this phosphorylation seems to be involved in erythroid differentiation; 2) GATA-1 binds to the cell cycle regulator retinoblastoma protein (pRb), and the resulting complex is essential for terminal erythropoiesis.We investigated the molecular mechanisms involved in the cell proliferation/differentiation balance during terminal erythropoiesis; in particular, we studied the molecular and physiological role of Epo-induced GATA-1 phosphorylation. Our findings suggest that this phosphorylation is one of the key processes in erythropoiesis dynamics. In its unphosphorylated form, GATA-1 can break cell cycle progression via GATA-1/pRb/E2F complex. This preliminary step is necessary for terminal erythroid differentiation. GATA-1 phosphorylation promotes GATA-1/pRb/E2F dissociation, allowing cell cycle progression, and GATA-1/FOG-1 binding, necessary to activate erythroid genes. Our model provides a molecular explanation for the arrest of terminal erythroid differentiation observed in the non-FOG-1-binding mutant GATA-1V205G. We show that the constitutive phosphorylation of GATA-1V205G and the increase of FOG-1 protein amount rescue erythroid differentiation in vitro. Finally, knock-in expression of unphosphorylatable GATA-1 in mice leads to lethal anemia when the IGF-1 signaling pathway is inhibited. This shows the importance of the molecular dynamics of GATA-1 phosphorylation, and highlights the major role of IGF-1 in erythropoiesis, in vivo.In conclusion, we propose a new molecular model for the control of the balance between proliferation and erythroid differentiation. GATA-1 phosphorylation by Akt coordinates the involvement of GATA-1 in two different functional protein complexes: GATA-1/pRb/E2F and GATA-1/FOG-1. We also highlight the major role of IGF-1 in compensating for the lack of GATA-1 phosphorylation in vivo.Avec plus de 100 milliards de globules rouges produits chaque jour, le lignage érythroïde présente la plus grande capacité de production cellulaire chez le mammifère adulte. Cette production requiert une balance fine entre la prolifération cellulaire, régulée principalement par la voie de signalisation érythropoïétine (Epo)/PI3K/Akt, et la différenciation érythroïde induite par le couple de facteurs de transcription GATA-1/FOG-1. Des interconnexions entre ces deux grands systèmes ont été décrites dans le laboratoire : 1) le facteur de transcription GATA-1 est phosphorylé par Akt en réponse à l’Epo et cette phosphorylation semble avoir un rôle dans la différenciation érythroïde ; 2) GATA-1 est capable d’interagir avec la protéine du rétinoblastome pRb, impliquée dans la régulation du cycle cellulaire, et le complexe formé est nécessaire à l’érythropoïèse terminale.L'objectif de ma thèse était d’étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la balance prolifération/différenciation cellulaire au cours de l’érythropoïèse, et en particulier de déterminer le rôle moléculaire et physiologique de la phosphorylation de GATA-1 par Akt en réponse à l’Epo. Nos travaux ont montré que cette phosphorylation est une des clefs de la dynamique de l’érythropoïèse. Dans sa forme non phosphorylée, GATA-1 ralentit le cycle cellulaire via le complexe GATA-1/pRb/E2F. Cette étape préliminaire est nécessaire à la mise en place de la différenciation érythroïde terminale. La phosphorylation de GATA-1 induit d’une part la dissociation de GATA-1/pRb/E2F favorisant l’expansion cellulaire, et d’autre part la formation du complexe GATA-1/FOG-1 nécessaire à l’activation des gènes érythroïdes. Ce modèle apporte une explication moléculaire au blocage de la différenciation érythroïde terminale induite par le mutant GATA-1V205G qui n’interagit pas avec FOG-1. Ainsi, la phosphorylation constitutive de GATA-1V205G et l’augmentation de la quantité relative de FOG-1 permettent de restaurer la différenciation érythroïde induite par ce mutant in vitro. Enfin, l’étude d’un modèle murin exprimant une protéine GATA-1 non phosphorylable par Akt montre l’apparition d’une anémie létale lorsque la voie IGF-1 est inhibée. Cela démontre l’importance de la dynamique moléculaire induite par la phosphorylation de GATA-1, et met en évidence le rôle majeur de l’IGF-1 dans l’érythropoïèse in vivo.En conclusion, nous proposons un nouveau modèle moléculaire de la régulation de la balance prolifération/différenciation érythroïde dans lequel la phosphorylation de GATA-1 par Akt coordonne la distribution de GATA-1 dans deux complexes protéiques fonctionnels différents : GATA-1/pRb/E2F versus GATA-1/FOG-1. Nous mettons également en évidence l’IGF-1 comme acteur central de la compensation mise en place in vivo pour pallier à l’absence de phosphorylation de GATA-1

Etude des mécanismes régulateurs de l'activité de la Matriptase-2 (recherche de ses partenaires impliqués dans le métabolisme du fer)

Dans l organisme, le fer assure le transport d oxygène jusqu à tous les organes, via l hémoglobine des globules rouges. L hepcidine, une hormone hépatique hyposidérémiante, contrôle le taux de fer sérique mis à disposition pour la synthèse de nouveaux globules rouges. La régulation de l hepcidine implique un grand nombre de protéines, dont l expression et l activité répondent à la charge en fer de l organisme. Récemment, la sérine protéase membranaire Matriptase-2 (MT2), synthétisée par le foie, a été identifiée comme actrice clé dans l inhibition de la synthèse d hepcidine. En effet, des mutations du gène Tmprss6 causent la synthèse de MT2 inactives, chez l Homme et la souris, menant à une hyperhepcidinémie ; cet excès d hormone génère une anémie de cause génétique, résistante à l apport en fer (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Suite à des expériences in vitro, il a été proposé que MT2 inhibe l expression de l hepcidine en dégradant l hémojuvéline (HJV), une protéine appartenant à la voie principale activant la synthèse de l hormone ; le clivage d HJV par MT2 bloquerait ainsi le signal passant par cette voie. Toutefois, des études in vivo ont montré que la protéine HJV exprimée par le foie diminue en absence de MT2. Le rôle de la protéase dans l inhibition de l hepcidine ne semble donc pas se limiter à l interaction et au clivage de HJV par MT2. Afin de mieux comprendre le fonctionnement de MT2 pour réguler l homéostasie du fer, nous avons donc étudié son rôle in vivo, en absence de Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), l activateur principal de la voie de régulation de l hepcidine (double knock-out Bmp6 Tmprss6), et durant le développement embryonnaire et post-natal. L analyse de ces modèles murins nous a ensuite incités à observer la conséquence d une surexpression de MT2 in vivo et in vitro : l excès d activité catalytique dans ces conditions montre l importance cruciale de réguler finement l expression et l activité des protéases. La synthèse de MT2 s effectuant presque exclusivement au niveau des hépatocytes, nous avons finalement cherché à identifier les partenaires et cibles potentielles de MT2 dans ces cellules exclusivement, en isolant des hépatocytes primaires de souris WT pour les comparer à ceux de souris Tmprss6-/-, par transfection, mais également en utilisant différentes techniques de protéomique. Ces études ont permis de préciser l importance de MT2 dans la régulation de l hepcidine, mais aussi à quel point il est nécessaire de contrôler l expression et l activité catalytique de cette protéase, et donc que ses partenaires sont indispensables à sa fonction.In the organism, iron takes care of oxygen transport until every organ, via haemoglobin of red blood cells. Hepcidin, a hepatic hyposideremic hormone, controls plasmatic iron levels at diposal for new erythroblasts synthesis. Hepcidin regulation implies a huge amount of proteins, whose activity and expression answer to iron body. Recently, membrane serine protease Matriptase-2 (MT2), synthetised by liver, has been identified as a key factor in hepcidin synthesis inhibition. Indeed, mutations of the Tmprss6 gene lead to synthesis of inactive MT2, in human and mouse, and result in hyperhepcidinemia: this excess of hormone generates an anemia of genetic cause, that resists to iron oral therapy (IRIDA: Iron-Refractory Iron Deficiency Anemia ; OMIM: 609862). Following in vitro experiments, it was suggested that MT2 inhibits hepcidin expression by degrading hemojuvelin (HJV), a protein part of the main signaling pathway positively regulating hepcidin synthesis; HJV cleavage by MT2 would then stop the signal. However, in vivo studies have shown that HJV expressed by the liver decreases in case of MT2 loss. The protease role in hepcidin inhibition seems to not be limited to HJV-MT2 interaction and cleavage. In order to better understand MT2 function in iron metabolism, we studied its role in vivo, when Bmp6 (Bone Morphogenetic Protein 6), the main activator of hepcidin regulatory pathway, is missing (double knock-out Bmp6 Tmprss6 mice), and during embryonic and postnatal development. Analysis of these mice models incited us to study the consequences of MT2 overexpression, in vivo and in vitro: excess of catalytic activity in these conditions show how crucial it is to tightly regulate proteases expression and activity. MT2 expression is almost exclusively restricted to hepatocytes; we then decided to identify its potential partners and targets in these cells, by isolating primary hepatocytes from WT mice, to compare them to Tmprss6-/- ones. These cells were transfected, and analysed by proteomic. These studies allowed us to precise MT2 importance in hepcidin regulation, but also how crucial it is to regulate expression and catalytic activity of this protease, and how its partners are essential for its role.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

Les espèces actives de l’oxygène : le yin et le yang de la mitochondrie

Il existe de nombreuses sources d’espèces actives de l’oxygène (EAO) dans la cellule ; malgré l’importance de chacune d’entre elles, la mitochondrie a été choisie comme sujet central de cet article en raison de son rôle primordial dans la bio-énergétique et du fait qu’elle constitue le site majeur de la production cellulaire d’EAO, 80 % de l’anion superoxyde provenant de la chaîne respiratoire. Cette production est indissociable du processus respiratoire et fortement modulée par les conditions environnementales : elle varie notamment selon l’intensité du métabolisme énergétique ou de la pression en oxygène, permettant aux cellules de s’adapter à ces changements environnementaux en activant des voies spécifiques de signalisation. Lorsque cette production d’EAO devient chronique, elle induit des effets délétères, le stress oxydant mitochondrial étant impliqué aussi bien en physiopathologie qu’au cours du vieillissement.Literature on reactive oxygen species (ROS) effects on cell biology and physiopathology is huge and appears to be controversial. This could be explained by the fact that very few studies take into account the real subcellular source of ROS production, their chemical nature and the intensity of their production. In spite of the importance of the other sites of ROS production in the cell, we decided to focus on mitochondrial ROS. Besides their key role in bioenergetics and ATP synthesis, mitochondria are one of the main sites of ROS generation within the cell. 80 % of intracellular superoxide anion is provided by the mitochondrial respiratory chain. Mitochondrial ROS production is closely associated with activity of the respiratory chain and is modulated by environmental factors which can induce constraints on respiratory chain components. Nutrient availability as well as oxygen pressure can both modulate mitochondrial ROS production. When moderately produced, ROS specifically regulate intracellular signalling pathways by reversible oxidation of proteins such as transcription factors or proteins kinases. In this way, they can trigger cell adaptation to environmental changes as modifications of energetic metabolism or hypoxia. Indeed, we demonstrated that mitochondrial ROS act as key elements in the control of white adipose tissue development by specific up-regulation of the anti-adipogenic transcription factor CHOP-10/GADD153. However, when they are produced at high level and in a chronic manner, mitochondrial ROS can also have deleterious effects by massive and irreversible oxidation of their principals targets i.e. lipids, DNA and proteins. In these conditions, mitochondrial ROS are involved in aging process and in pathological situations as metabolic disease

Rôle du facteur de transcription BP1 dans la régulation des gènes du locus humain de beta-globine

Le facteur de transcription BP1 humain est exprimé dans les cellules érythroïdes pendant le développement fœtal mais son niveau d’expression est réduit au stade adulte. Les études antérieures in vitro ont montré que BP1 est un répresseur du gène adulte de β-globine mais sa fonction dans la régulation des gènes ε et γ n’a pas été abordée à ce jour. Dans notre étude, nos analyses de BP1 humain ont été menées in vivo au stade embryonnaire en utilisant une lignée de souris transgénique surexprimant BP1 dans les cellules érythroïdes définitives murines. Au niveau protéique, BP1 humain est exprimé aux âges E12.5 et E13.5 dans les cellules érythroïdes fœtales des embryons transgéniques. Toutefois, les niveaux de BP1 humain ne perturbent pas l’érythropoïèse définitive fœtale: les embryons transgéniques ne sont pas anémiques et ne meurent pas in utero. La surexpression de BP1 humain altère tout de même le niveau endogène des facteurs de transcription Ikaros et SOX6 impliqués dans la régulation des gènes de β-globine durant l’érythropoïèse définitive fœtale murine. Chez les embryons doubles transgéniques exprimant BP1 et les gènes humains de β-globine à E12.5, l’expression du gène adulte β est réduite alors que celle des gènes ε et γ est non réprimée. Les mesures d’expression des gènes humains de β-globine effectuées en absence d’Ikaros à E12.5 précisent le rôle de BP1 humain dans l’activation du gène embryonnaire ε. Dans les cellules érythroïdes fœtales murines dépourvues d’Ikaros à E12.5, BP1 humain augmente grandement l’expression des facteurs de transcription EKLF et BCL11A et semble déréprimer l’expression de SOX6, ce qui conduit à une répression des gènes fœtaux et une activation du gène adulte β au jour embryonnaire murin suivant. Puisque BP1 atténue l’altération de l’expression des gènes fœtaux et adultes causée par l’absence d’Ikaros, nous proposons que BP1 et Ikaros soient liés dans les mécanismes de transcription des gènes humains de β-globine.The transcription factor BP1 is expressed in erythroid cells during fetal development but is downregulated at adult stage. In vitro previous studies revealed that BP1 acts as a repressor of adult β-globin gene expression but its function in ε and γ globin gene regulation has not been investigated so far. In our studies, BP1 functions analyses were proceeded in vivo at embryonic stage by using a transgenic mouse line overexpressing human BP1 in murine definitive erythroid cells. At protein level, human BP1 is expressed in E12.5 and E13.5 fetal erythroid cells of transgenic embryos. However, levels of human BP1 do not impair murine fetal definitive erythropoiesis : transgenic embryos are not anemic and survive during gestation. Overexpression of human BP1 impairs, nonetheless, endogenous level of the transcription factors Ikaros and SOX6 involved in β-globin gene regulation during murine fetal definitive erythropoiesis. In double transgenic mice expressing BP1 and human β-globin genes at embryonic day E12.5, β gene expression is reduced whereas ε- and γ-globin genes are not repressed. Measurements of β-globin gene expression in absence of Ikaros pinpoint the role of human BP1 in embryonic ε-globin gene activation. In E12.5 Ik-/- murine fetal erythroid cells, human BP1 highly increases EKLF and BCL11A transcription level and seems to derepress SOX6 expression which lead to γ silencing and β activation at E13.5. Since BP1 attenuates globin gene alterations caused by absence of Ikaros, we propose that BP1 and Ikaros are linked in transcriptional mechanisms of human β-globin genes

Mécanisme d’action du PBI-1402 impliqué dans l’expansion des progéniteurs érythroïdes humains et murins

Une des complications importantes d’un traitement intensif de chimio/radio-thérapie est l’aplasie de la moelle osseuse qui peut persister longtemps même après une greffe de cellules souches. Le PBI-1402 est un petit lipide qui a été associé à la diminution de l’apoptose des neutrophiles induite par des agents cytotoxiques. Nos travaux ont démontré que la culture in vitro de progéniteurs hématopoiétiques humains en présence de PBI-1402 induit une augmentation significative du nombre de progéniteurs érythroides (PEryth) (p<0,05). En évaluant la sensibilité des PEryth à l’érythropoietine (Epo), nous avons démontré que le PBI-1402 n’a pas d’effet sensibilisateur et que les cellules répondent de façon similaire aux cellules contrôles. De plus, la combinaison de l’Epo et du « stem cell factor » avec le PBI-1402 permet de prolonger et d’augmenter l’activation d’ERK1/2 (p<0,05), un important signal mitogène. Cet effet est associé à une inhibition de l’activation de la phosphatase MKP-1 dans les cellules exposées au PBI-1402. Nous démontrons aussi la capacité du PBI-1402 à amplifier la prolifération des PEryth et sa capacité à réduire la durée et l’intensité de l’anémie dans un modèle in vivo murin. Des souris ayant reçu une dose létale d’irradiation et subi une transplantation syngénique de moelle osseuse, ont été traitées oralement avec le PBI-1402 pendant 14 jours. Ces souris démontrent une réduction significative de l’anémie post-transplantation versus les souris contrôle (p<0,05). De plus, la moelle osseuse des souris traitées au PBI-1402 présente un nombre de BFU-E et CFU-E plus élevé comparativement au contrôle. Ces résultats démontrent donc le potentiel du PBI-1402 à réduire l’anémie post-transplantation et accélérer la reconstitution érythroïde.One of the most important complications of intensive radiotherapy or chemotherapy is cytopenia, which can persist for significant amount of time even after stem cell transplantation. PBI-1402, a small lipid, was previously shown to be associated with decreased neutrophil apoptosis caused by cytotoxic agents. Our work has shown that day primary human hematopoietic cell in vitro culture in the presence of PBI-1402 resulted in an increased number of erythroid progenitors (p<0,05). Dose-response experiments evaluating sensitivity to erythropoietin (Epo) of cells exposed to PBI-1402 indicated that PBI-1402 did not have a sensitizing effect and that both treated and control cells respond similarly to Epo. In addition, PBI-1402, used in combination with stem cell factor (SCF) and Epo, enhanced and prolonged ERK1/2 phosphorylation (p<0.05), a signalling pathway important for erythroid progenitor cell proliferation. This effect was associated with a decrease of the phosphatase MKP-1 activation in PBI-1402 exposed cells. This translated into and increased proliferation of erythroid progenitors as well as a reduced duration and level of anemia in an in vivo murine transplantation model. Lethally irradiated mice that received syngeneic stem cell transplantation were treated orally with PBI-1402 for 14 days. These mice demonstrated a significant reduction in post-transplantation anemia in a dose dependent manner compared to control (vehicle)(p<0.05). Moreover, PBI-1402-treated mice harboured significantly higher numbers of BFU-E and CFU-E in bone marrow compared to control (p<0.05). These results demonstrate that PBI-1402 treatment significantly reduced transplantation-induced anemia with concomitant acceleration in erythroid recovery

Caractérisation du statut en fer chez des chiennes en santé avant et après une intervention chirurgicale

Contexte: L’anémie d’inflammation est une condition fréquemment rencontrée en médecine vétérinaire et humaine. L’hepcidine est une protéine récemment découverte jouant un rôle prépondérant dans le métabolisme du fer et conséquemment l’anémie de condition inflammatoire. Objectif: Caractériser le statut en fer chez des chiennes en santé avant et après une chirurgie d’ovariohystérectomie (OVH). Méthode: Étude prospective. 29 chiennes en santé ont subi une chirurgie d’OVH. Avant et 14 à 18h après le début de la chirurgie, les tests suivants ont été réalisés sur du sang ou du sérum: hématologie, fer, ferritine, hepcidine, interleukine-6 (IL-6) ainsi que protéine C-réactive (CRP). Un ELISA canin pour l’IL-6 et un ELISA humain pour l’hepcidine ont été utilisés. Résultats: Les concentrations moyennes des leucocytes, des neutrophiles, de la CRP et de l’IL-6 étaient significativement plus élevées après la chirurgie (p < 0.0001). Une diminution marquée et significative du fer sérique (p < 0.0001) accompagnée d’une augmentation significative de l’hepcidine (p = 0.04) sans changement au niveau de la ferritine (p = 0.75) étaient également notés après la chirurgie. Conclusions: Les résultats indiquent qu’une chirurgie d’OVH est un modèle d’inflammation systémique ayant un impact sur le métabolisme du fer. Avec une validation complète chez le chien, l’hepcidine sérique pourrait devenir un élément clé dans la caractérisation des déficiences fonctionnelles en fer et de l’anémie d’inflammation chez ces sujets.Background: Anemia of inflammation is a frequent condition in veterinary and human medicine. Hepcidin, a recently discovered protein, is a key player in iron metabolism and consequently in anemia of inflammation. Objective: To characterize the iron status in healthy female dogs before and after an ovariohysterectomy (OVH). Methods: Prospective study. 29 healthy female dogs had an OVH surgery. Before and 14-18 hours after the beginning of the surgery, the following tests were performed on blood or serum: complete blood count, iron, ferritin, hepcidine, interleukin-6 (IL-6), and C-reactive protein (CRP). IL-6 and hepcidine were measured with a canine and human ELISA, respectively. Results: Mean leukocytes, neutrophils, CRP and IL-6 concentration were significantly higher following the surgery (p < 0.0001). A marked and significant decrease in serum iron (p < 0.0001) accompanied by a significant increase in hepcidin (p = 0.04) without changes in ferritin concentration (p = 0.75) following the surgery were also observed. Conclusion: The results indicate that OVH surgery is a model of systemic inflammation and that it has an impact on iron homeostasis. With further validation in dogs, a serum hepcidin assay may become a key tool in characterizing functional iron deficiency and anemia of inflammation in this species

Impact d une carence martiale sans anémie sur la performance sportive, intérêt d une supplémentation ?

Le métabolisme du fer est perturbé par la pratique de toute activité sportive intense, notamment d endurance. L inflammation, l hémolyse, la production d oxyde nitrique ou encore les pertes sanguines tendent à exposer les athlètes à un statut en fer sous-optimal. Et ce d autant plus chez des femmes avec des volumes d entraînement élevés, un indice de masse corporelle bas et des menstruations abondantes. La carence martiale est donc un phénomène très fréquent chez les athlètes. L importance du fer chez le sportif tient à son rôle dans le transport de l oxygène par l hème de l hémoglobine. Or il existe une relation directe entre le taux d hémoglobine et la consommation maximale d oxygène. Une altération du statut martial peut s accompagner d une baisse de la performance sportive. La difficulté majeure provient du fait qu en l absence d anémie, il n y a pas de consensus scientifique établi quand aux valeurs du bilan hématologique et martial à partir desquelles initier une supplémentation en fer. Les pharmaciens peuvent être confrontés aux demandes des sportifs, amateurs ou professionnels, et doivent être à même de pouvoir fournir une prise en charge optimale de ces patients. Cela passe par une bonne connaissance du métabolisme du fer, la dispensation de conseils appropriés à la nutrition du sportif et si nécessaire savoir conseiller le plus pertinent des compléments à la vente dans son officine.Iron metabolism is disturbed by the practice of any intense physical activity, including endurance. Inflammation, hemolysis, the production of nitric oxide or blood loss tend to exhibit athletes to a suboptimal iron status. And especially for women with high training volumes, a low body mass index and heavy periods. Iron deficiency is a very common phenomenon within athletes population. The importance of iron within athletes population is its role in the transport of oxygen by the heme of hemoglobin. But there is a direct relationship between hemoglobin and maximal oxygen consumption rates. Impaired martial status may be accompanied by a decrease in athletic performance. The major difficulty is that in the absence of anemia, there is no scientific consensus reached when the values of hematological and martial from which initiate iron supplementation. Pharmacists may face the demands of athletes, amateur or professional, and must be able to provide optimal care for these patients. This requires a good knowledge of iron metabolism, the provision of appropriate advice to the sports nutrition knowledge and if necessary advises the most appropriate supplements for sale in his shop.GRENOBLE1-BU Médecine pharm. (385162101) / SudocSudocFranceF