高感度イムノセンシング系の構築を指向した固相基板上への抗体固定化技術の開発

イムノセンシングは、抗原抗体反応を利用した分析技術であり、生体成分等を対 象とした分析に幅広く活用されている。このイムノセンシングでは、一般に抗体を 固相基板上に固定化する必要があり、この抗体の固定化が分析性能に大きな影響を 及ぼすことが知られている。そこで、本研究では、高感度なイムノセンシング系の 構築を目指し、特殊な酵素反応系と抗体結合タンパク質を組み合わせた、固相基板 上への抗体固定化技術の開発を行った。具体的には、古細菌Sulfolobus tokodaii 由 来のビオチン化酵素反応系と、黄色ブドウ球菌由来の抗体結合タンパク質である Protein A の抗体結合ドメイン（Z-domain）を利用した。S. tokodaii 由来の同酵素反 応系は、ビオチンリガーゼ（BPL）がビオチン化された基質タンパク質（BCCP） と非常に安定な複合体を形成するという性質を有している。本研究では、この特性 を活用してZ-domain を固相基板上へ固定化し、それを介して抗体を固定化する技 術の開発を行った。 まず、高感度なイムノセンシング系を簡便に構築することを目的として、一段階 のビオチン化反応に基づいた抗体固定化技術の開発を行った。具体的には、遺伝子 工学的手法を利用して、Z-domain とBCCP を連結した融合タンパク質（Z-BCCP） を作製し、その融合タンパク質を、ビオチン化反応を介して固相基板上へ固定化す る技術の開発を行った。ここでは、固相基板として水晶発振子マイクロバランス （QCM）法のセンサーチップを利用し、その振動数変化から基板上へのタンパク 質の結合量を評価した。ビオチン化反応に基づいてZ-BCCP を固定化したQCM セ ンサーチップ上に、抗体を添加したところ、顕著な振動数の低下が見られ、さらに 抗原の添加に伴い再び大きな振動数の低下が見られた。これより、本手法を利用し てセンサーチップ上に、抗体を捕捉し、抗原抗体反応を検出できることがわかった。 さらに、本手法の有用性を評価するために、抗体を直接センサーチップ上に物理吸 着させた系との比較を行った。その結果、本手法を利用した系の方が、10 倍以上 大きなレスポンスの変化を示し、本手法を利用してより高感度なイムノセンシング 系を構築することが可能であることを示すことができた。 次により高感度なイムノセンシング系を構築することを目的として、多段階のビ オチン化反応を利用した抗体固定化技術の開発を行った。ここではまずZ-domain の両端にBCCP とBPL を連結した融合タンパク質（BCCP-Z-BPL）を用いた技術の 開発を試みた。BCCP-Z-BPL は、その分子内に会合ユニット１セット有するため、 BPL を固定化した基板上に、この融合タンパク質を連続的に添加し、多段階的にビ オチン化反応を行うことにより、基板上でZ-domain のポリマーを形成できるもの と考えた。実際に、この融合タンパク質を作製し、基板上で同タンパク質のポリマーを固定化することには成功したが、そのポリマー化反応を制御することが困難で あることがわかった。 そこで、次に別のアプローチによるZ-domain のポリマー化を試みた。ここでは、 BPL 二分子を連結したBPL ダイマーと、Z-domain の両端にBCCP を連結した融合 タンパク質（BCCP-Z-BCCP）を利用した。この系ではBPL を固定したセンサーチ ップ上に、BCCP-Z-BCCP とBPL ダイマーを交互に添加することにより、基板上に Z-domain のポリマーを、その重合度を制御して固定化できるものと考えた。実際 にBPL を固定化した表面プラズモン共鳴（SPR）法のセンサーチップ上に両タン パク質を段階的に添加し、そのレスポンスの変化を観察したところ、両タンパク質 の添加に伴い、各段階でSPR シグナルの増大が観察された。これより期待通り、 BCCP-Z-BCCP とBPL ダイマーを利用して、Z-domain のポリマーを任意の重合度 でセンサーチップ上に固定化できることがわかった。さらに、このセンサーチップ に対して、抗体及び抗原を添加すると顕著なSPR シグナルの増大が観察され、イ ムノセンシング系として活用できることも確認できた。現段階ではまだZ-domain のポリマー化に伴う検出感度の増大効果は限定的であるが、今後、実験系の最適化 を行うことにより、非常に高感度なイムノセンシング系を構築することも可能であ ると考えられる。さらに、本技術は、他のタンパク質の固定化にも適用できる新規 なアプローチであるため、学術的にも価値の高い研究であると言える。九州工業大学博士学位論文 学位記番号:情工博甲第326号 学位授与年月日:平成29年3月24日第１章 序論|第２章 実験方法|第３章 実験結果および考察|第４章 結論九州工業大学平成28年

Immobilization of Antibody on Polystyrene Microbeads and Application for Immunoassay in Human Serum

摘要 液相芯片是一种多功能新型生物芯片平台，与传统的固相芯片相比，液相芯片具有灵活性好、检测通量高、反应分析时间短、操作方便等明显的优势，广泛应用于核酸杂交分析、免疫学或者基于免疫学原理进行的分析、高通量药物筛选等研究。在液相芯片中，其核心元件功能化微珠承担着分子识别和信号表达的重要任务，微珠表面生物探针分子的固定化效果直接影响芯片的灵敏度、检测限等，因此，研究微珠表面生物分子的固定化方法十分重要。 本论文基于构建液相芯片敏感元件并用于血清中肿瘤标志蛋白检测的目的，重点研究了液相芯片敏感元件聚苯乙烯微珠的活化及表面抗体分子固定化的方法，优化了分析条件，并用于血清样品的检测。研究工作主要有以...Abstract Liquid chip is a versatile biochip platform. Compared to conventional solid chip, it has some advantages such as good flexibility, high throughput, short response time and easy operation, and so is widely used in nucleic acid hybridization analysis, immunological analysis and high throughput drug screening. Functional microbeads which were core components of liquid chip undertake the imp...学位：理学硕士院系专业：化学化工学院化学系_分析化学学号：2052007115097

血清アルブミンの化学修飾オミクスに基づくバイオマーカー探索法の研究

Tohoku University大江知

Rapid immunosensing based on dielectrophoretic manipulation of particles

A rapid immunosensing method for measuring two tumor markers, alpha-fetoprotein (AFP) and carcinoembryonic antigen (CEA), based on particle manipulation by negative dielectrophoresis (n-DEP) was developed. When microparticles modified with different antibodies were subjected to n-DEP manipulation by the application of an AC voltage, they accumulated in particular positions in poly(dimethylsiloxane) (PDMS) fluidic channels modified with corresponding antibodies within 1 min. The presence of a specific antigen, AFP or CEA, allowed the irreversible capture of microparticles via the formation of immuno-complexes. Uncaptured microparticles redispersed after the AC voltage was switched off. The fluorescent intensity from the irreversibly captured microparticles allowed us to determine the concentration of AFP and CEA in the sample. The range for both AFP and CEA assays was 0.1-100 ng/mL, which was sufficient to cover the concentration required for medical diagnoses. Our system measured the concentrations of AFP and CEA simultaneously in a single device with two channels modified for different antibodies. Since n-DEP was used for the rapid manipulation of the microparticles toward the PDMS surface, the time required for the assay was substantially short: 1 min for forcing and 5 min for redispersion of microparticles and sensing

微細加工技術を利用した化学物質検出用イムノアッセイの高度化

Tohoku University渡部良朋課

Sensing elements of polystyrene microbeads-based chemical surface modification,oriented antibody immobilization and catalyzed reporter deposition technique

肿瘤患者血清中肿瘤相关性蛋白质因子的灵敏、准确检测对于肿瘤早期诊断和治疗具有十分重要的意义。检测灵敏度的提高关键在于信噪比的提高，在液相芯片检测体系中，信噪比的提高涉及：改善其核心元件微球的表面生物探针分子的固定化效果，特别是实现定向固定以提高捕获待测靶分子的能力；非特异性检测背景的降低；以及检测信号放大等多方面。本文基于优化以聚苯乙烯微球为敏感元件的液相芯片免疫分析体系，应用于临床血清样品中肿瘤标志蛋白的检测，以提高检测灵敏度为目的，在以上三个方面做了相应研究。研究工作主要有以下三部分： 第一章介绍液相芯片的基本原理和提高芯片免疫分析灵敏度的组合策略。一、介绍了固相载体表面探针分子的不同化...Improving the assay sensitivity of bioanalysis and lowering the detecting limits of trace analytes can improve the early detection rate of some marker proteins of serious disease, thus it is of great significance in early diagnosis and treatment of these diseases,especally the malignant neoplasm. Since the sensitivity of any assay system is dependent upon signal to noise ratio, in flow cytometric ...学位：理学硕士院系专业：化学化工学院_分析化学学号：2052010115151

Surface Modification of Polystyrene Microbeads Using Poly Ethylene Glycol for Suppressing Nonspecific Adsorption

固相表面的改性与修饰是抑制芯片分析平台敏感元件的非特异性吸附、提高分析方法灵敏度和选择性的重要研究内容。聚乙二醇（[CH2CH2O]n，PEG）是一种由环氧乙烷开环聚合形成的直链或枝状聚醚。它最重要的性质就是强极化性质以及由此带来的亲水性与水溶性。由于PEG本身所具有的特殊性质，一直以来研究者都在使用它作为增加基质表面亲水性和抵抗非特异性吸附的中心物质。基于微球表面改性以降低非特异性蛋白吸附的目的，本论文重点研究不同原理与形式的微球表面PEG改性方法和实验条件，并应用于血清样品的检测。研究工作主要有以下四部分： 第一章介绍液相芯片的基本原理和对基质进行表面改性的物质基础及实验策略。本章详细介...Surface modification of the substrates applied in the biochip analysis helps suppress nonspecific protein adsorption as well as improve the sensitivity and detection limit of trace analytes, and thus is of importance in biochip analysis. Polyethylene glycol (PEG) is a widely-used reagent for the depression of protein adsorption. The resistant ability and biological compatibility of PEG arises from...学位：理学硕士院系专业：化学化工学院化学系_分析化学学号：2052009115132