A binary interaction map between turnip mosaic virus and Arabidopsis thaliana proteomes

[EN] Viruses are obligate intracellular parasites that have co-evolved with their hosts to establish an intricate network of protein-protein interactions. Here, we followed a high-throughput yeast two-hybrid screening to identify 378 novel protein-protein interactions between turnip mosaic virus (TuMV) and its natural host Arabidopsis thaliana. We identified the RNA-dependent RNA polymerase NIb as the viral protein with the largest number of contacts, including key salicylic acid-dependent transcription regulators. We verified a subset of 25 interactions in planta by bimolecular fluorescence complementation assays. We then constructed and analyzed a network comprising 399 TuMV-A. thaliana interactions together with intravirus and intrahost connections. In particular, we found that the host proteins targeted by TuMV are enriched in different aspects of plant responses to infections, are more connected and have an increased capacity to spread information throughout the cell proteome, display higher expression levels, and have been subject to stronger purifying selection than expected by chance. The proviral or antiviral role of ten host proteins was validated by characterizing the infection dynamics in the corresponding mutant plants, supporting a proviral role for the transcriptional regulator TGA1. Comparison with similar studies with animal viruses, highlights shared fundamental features in their mode of action.We thank Francisca de la Iglesia and Paula Agudo for excellent technical assistance and the rest of the EvolSysVir lab for fruitful discussions. This work was supported by grants PID2019-103998GB-I00 and PGC2018-101410-B-I00 (Agencia Estatal de Investigacion - FEDER) to S.F.E. and G.R., respectively, and PROMETEO/2019/012 (Generalitat Valenciana) to S.F.E.Martínez, F.; Carrasco, JL.; Toft, C.; Hillung, J.; Giménez-Santamarina, S.; Yenush, L.; Rodrigo Tarrega, G.... (2023). A binary interaction map between turnip mosaic virus and Arabidopsis thaliana proteomes. Communications Biology. 6(1):1-18. https://doi.org/10.1038/s42003-023-04427-81186

Molecular insights into a putative potyvirus RNA encapsidation pathway and potyvirus particles as enzyme nano-carriers

The present study intended to identify new strategies for the selective presentation of biocatalyst on the surface of viral nanoparticles with potential application in biosensor technology or protein chips. Potyviruses were chosen as model nano-scaffolds for biocatalysts. Potyviruses are the largest genus in the family Potyviridae and cause significant plant damage. They form flexible rod-shaped capsids surrounding a single stranded positive sense RNA molecule. The molecular events leading to the specific selection and encapsidation of potyviral RNA are unknown. To better exploit the potential of these viruses as nano-carriers, the first step in this study was to look into their in vivo RNA encapsidation process. Earlier studies showed that Potato virus A (PVA) coat protein (CP) interferes with viral RNA translation when provided in excess in trans and it was suggested this could occur to initiate viral RNA encapsidation. In this follow up study, we used the ago-infiltration approach for the transient expression of full length, truncated or mutated viral RNAs with wild type CP (CPwt) and showed that this inhibition is mediated by co-translational CP-CP interactions occurring between two CP populations, produced in trans and in cis. Because CP inhibited translation of the entire viral genome and virus particles were formed (which were less abundant and appeared latter than during normal infection), it was assumed that the CP acted during this inhibition process to specifically recruit viral RNA for encapsidation. In line with previously published in vitro assembly studies, we propose a mechanism through which viral RNA encapsidation is initiated through co-translational CP-CP interactions. The second part of this work entailed the investigation of novel approaches for organizing biocatalyst on virus platforms. The aim was to be able to control the display of enzymes on virus surfaces while maximizing channelling of reaction intermediates. Three strategies were investigated: the first involved the use of specific PVA CP binding peptides selected by phage display, the second involved the use of heterodimeric leucine zippers and the last involved the use of an antibody binding peptide, the z33 peptide, from Staphylococcus aureus. The first two strategies were unsuccessful. On the other hand, the z33 strategy enabled an 87 % occupancy of accessible sites on the potyvirus particles by the enzyme. To further test the potential of potyviruses as multi-enzyme nano-carriers, two enzymes, 4-coumarate:coenzyme A ligase (4CL2) and stilbene synthase (STS), catalyzing consecutive steps in resveratrol synthetic pathway were employed as model biocatalysts. The z33-peptide was fused to the N-terminus of these enzymes, z4CL2His and zSTSHis and a chimera-protein, z4CL2::STSHis was also generated by the genetic fusion of both enzymes. All enzymes were active and resveratrol was synthesized from both mono-enzymes and the protein chimera either in solution or adsorbed on potyvirus particles. The latter was illustrated by trapping the mono-enzymes or the protein chimera from clarified soluble E. coli cell lysates on to the surface of potyvirus particles immobilized on the surface of a polypropylene tube. This strategy brings together a bottom-up and top down approach for designing virus based nano-materials and offers a cost effective and efficient way to co-immobilize and purify enzymes.Työn tavoitteena oli löytää uusia strategioita entsyymien järjestämiseksi viruspartikkeleiden pinnoille halutulla tavalla. Potentiaalisia sovellutusalueita entsyymi-pinnoitetuille nanopartikkeleille ovat esimerkiksi biosensori ja biosiruteknologiat. Työssä tutkittiin, voidaanko potyviruksia käyttää entsyymien nanokokoisina tarttumapintoina ja reaktioalustoina. Potyvirukset ovat Potyviridae heimon suurin suku. Ne aiheuttavat merkittäviä satotappioita. Potyvirusten RNA genomia suojaa joustava, nauhamainen virus partikkeli. Rakenneproteiini, jota kutsutaan kuoriproteiiniksi, muodostaa 95 %:a ja viruksen RNA genomi 5 %:a partikkelin painosta. Potyviruspartikkelin muodostumisen infektion aikaista mekanismia ei täysin tunneta, mutta tämän prosessin tutkiminen saattaa avata uusia mahdollisuuksia hyödyntää potyviruksia entsyymien kantajina. Koska partikkelinmuodostus on tärkeä virusinfektion vaihe, saatu informaatio voi samalla palvella etsittäessä virusten lisääntymistä estäviä strategioita. Tässä työssä osoitimme, että potyviruksilla partikkelinmuodostusta mahdollisesti ohjaa tuotettujen kuoriproteiinimolekyylien ja parhaillaan tuotettavana olevan kuoriproteiinimolekyylin väliset vuorovaikutukset proteiinisynteesin aikana. Potyviruspartikkelit tarjoavat suuren yhtenäisen tarttumapinnan entsyymeille. Työn seuraavassa vaiheessa tutkimme erilaisia entsyymien kiinnittämismenetelmiä ja havaitsimme, että Staphylococcus aureus bakteerista peräisin olevaa vasta-aineisiin sitoutuvaa z33 peptidiä voidaan hyödyntää monipuolisesti tähän tarkoitukseen. Z33 peptidi sitoutui partikkeleihin potyviruksen kuoriproteiinia tunnistavan vasta-aineen kautta, siten että kiinnittyneet entsyymit kattoivat 87 %:a viruspartikkeleista. Käytimme tätä strategiaa kahta peräkkäistä resveratrolin biosynteesireitin reaktiota katalysoivan entsyymin, 4-kumaraatti:koentsyymi A ligaasin (4CL2) ja stilbeeni syntaasin (STS), kiinnittämiseen. Tuotimme 4CL2 ja STS entsyymit Escherichia coli bakteereissa ja keräsimme liukoiset entsyymit vasta-aine-partikkelikompleksien pinnalle suoraan rikottujen solujen vapauttamasta nesteestä. Aktiivinen resveratrolin synteesi osoitettiin polypropyleeniputkeen kiinnitetyn viruskompleksin pinnalla. Työssä yhdistettiin bottom-up lähestymistapa, joka hyödyntää potyvirusten partikkelinmuodostumiskykyä ja top down lähestymistapa, jossa entsyymejä kantavat partikkelit kiinnitetään alustoille, tuotettaessa potyvirus-pohjaisia entsyymikantajia pyrkimyksenä kehittää taloudellinen ja tehokas entsyymien puhdistus- ja kiinnitysstrategia

VPg-eIF(iso)4E interaction, coat protein production and virion formation in potato virus A infection

Potato Virus A (PVA), which belongs to the family Potyviridae, is a significant agricultural plant virus that causes crop loss worldwide. Most potyvirus resistance is recessive and occurs due to the loss of interaction between the viral protein genome linked (VPg) and the host eukaryotic initiation factor [eIF4E/(iso)4E]. This interaction has been demonstrated in many cultivated plants that are susceptible to potyviruses. Studies on potyvirus resistance have shown that minute changes in either eIF4E/(iso)4E or VPg can cause the interaction to fail, resulting in the development of viral resistance. However, the detailed mechanisms underlying the significant effects of this interaction during potyvirus infection remain unclear. The central domain of the PVA VPg contains an eIF(iso)4E-binding consensus motif, Tyr-X-X-X-X-Leu-phi (YXXXLΦ). The function of this motif during the VPg–eIF(iso)4E interaction, in the context of PVA infection, was investigated in the present study. The tyrosine and the leucine residues at the binding site were replaced with alanine residues in PVA infectious cDNA (icDNA, PVAVPgmut) and in a VPg expression construct (VPgmut). The results showed that PVAVPgmut was capable of replicating inside the host cell, but overall gene expression remained low, similar to the levels observed for a replication-deficient virus. Systemic infection in PVAVPgmut-infected plants only occurred upon reversion to the wild-type PVA, which occurred in 26% of PVAVPgmut-infected plants by 15 days postinfection. Although VPg typically stabilises viral RNA (vRNA) and 3’ renilla luciferase (RLUC) expression, as published previously, the VPgmut failed to perform these functions. The helper component proteinase (HCPro) induces the generation of PVA-induced granules (PGs) during infection and the assembly of vRNA within these PGs to safeguard vRNA from being silenced. Plants infected with PVAVPgmut showed an increased number of PG-like foci in infected cells as compared to the plants infected with PVAWT. However, in compare to the PVAWT the percentage of PVA RNA colocalising with PGs was significantly low in PVAVPgmut infected leaf samples. The host eIF(iso)4E is thought to bind to the PVA VPg via the YXXXLΦ motif, and this interaction is considered to be essential for PVA RNA stabilisation, the transfer of RNA to the RNA silencing suppression pathway, and RNA translocation to polysomes for viral protein synthesis. In the second study, an alternative mechanism was explored involving the production of large quantities of coat protein (CP), which is a multi-functional protein. Tight control over CP production is necessary, depending on the stage of virus infection. Increased CP concentrations have been shown to represses potyviral gene expression. Therefore, CP concentrations are maintained at low levels during active gene expression in the early infection stage through a host-mediated degradation system. During later infection stages, CP is required at high quantities for the production of a large number of stable particles. The present study showed that ectopically expressed VPg enhances reporter expression more pronouncedly from the 3' side of the genome than from the 5’ side. A similar phenomenon was observed towards the later stages of the infection, in which the 3’ CP cistron and the 3’ reporter cistron were expressed more pronouncedly than the central cylindrical inclusion (CI) cistron and the 5’ reporter cistron. The 3’CP and 3’ reporter protein showed different production/accumulation dynamics than were observed for the rest of the genome. CP expression levels were observed to increase in the presence of overexpressed VPg, during both the early infection stage and towards the later infection stage. This process could represent the mechanism through which potyviruses increase CP production for sufficient virion formation. In the third study of this thesis, whether the stabilisation of CP was necessary for successful virion formation was investigated. These results revealed the function of PVA HCPro during CP stabilisation and virion formation. HCPro was found to be unable to stabilise CP in a virus-free system. A number of additional host and viral factors are necessary to produce stable particles. CP stability by HCPro is unrelated to its capacity for silencing suppression and, therefore, cannot be complemented by other viral silencing suppressors. Together, the findings described in this dissertation revealed important mechanisms that underlie potyvirus recessive resistance and the factors that affect stable virion formation.Potyvirdae heimoon kuuluva perunan A virus (PVA) on merkittävä kasvivirus, koska se aiheuttaa maataloudelle satotappioita maailmanlaajuisesti. Suurimmaksi osaksi tunnettu kestävyys potyviruksia vastaan on resessiivistä ja johtuu siitä, että viruksen genomiin linkittyvän VPg-proteiinin ja isäntäkasvin eukaryoottisen initiaatiofaktori eIF4E/(iso)4E:n välillä esiintyvä vuorovaikutus on estynyt. Kyseinen vuorovaikutus on osoitettu useissa potyviruksella infektoituneessa viljelykasvissa. Potyviruskestävyyttä tutkittaessa on todettu, että hyvin pienetkin muutokset eIF4E/(iso)4E:ssä ja VPg:ssä voivat johtaa infektion epäonnistumiseen ja viruskestävyyden kehittymiseen. Se, mistä tämän vuorovaikutuksen merkittävät vaikutukset täsmällisesti johtuvat molekulaarisen mekanismin tasolla on jäänyt epäselväksi. PVA:n VPg:n aminohapposekvenssin keskellä on eIF(iso)4E:tä sitova konsensusmotiivi, Tyr-X-X-X-X-Leu-phi (YXXXLΦ). Tässä tutkimuksessa selvitettiin VPg–eIF(iso)4E vuorovaikutuksen tehtävää PVA infektiossa. Sitoutumisen konsensusmotiivin tyrosiinin ja leusiinin kodonit vaihdettiin alaniinin kodoneiksi PVA:n infektiivisessä cDNA:ssa (PVAVPgmut) ja VPg:n ekspressiokonstruktissa (VPgmut). Tulokset osoittivat, että PVAVPgmut pystyi replikoitumaan isäntäsolussa, mutta geeniekspressiotaso pysyi matalana, samalla tasolla kuin replikaatiokyvyttömällä PVA mutanttiviruksella. PVAVPgmut mutanttivirus aiheutti systeemisen infektion kasvissa vain silloin, jos se muuntui takaisin villityyppiseksi PVA:ksi. Tämä tapahtui 26%:ssa kasveista 15 päivän sisällä infektioista. Vaikka VPg tyypillisesti stabiloi PVA RNA:ta ja vahvistaa virusgenomin 3’päästä tuotetun Renilla lusiferaasireportterin ilmentymistä, kuten aiemmin on julkaistu, VPgmut ei tähän kyennyt. Viruksen HCPro proteiini aloittaa PVA infektion indusoimien granuloiden (PG) muodostuksen ja virus RNA:n (vRNA) assosioituminen näihin rakenteisiin suojaa sitä geenihiljennykseltä. PVAVPgmut mutanttiviruksella infektoiduissa soluissa PG:n kaltaiset rakenteet lisääntyivät villityyppisellä PVA:lla infektoituihin soluihin verrattuna. Kuitenkin vRNA:n assosioituminen PVAVPgmut infektiossa esiintyviin rakenteisiin oli merkittävästi vähäisempää kuin normaalin infektion aikana. Näyttää siis siltä, että isännän eIF(iso)4E sitoutuu PVA VPg: hen YXXXLΦ-motiivin kautta ja että tämä vuorovaikutus on välttämätön PVA RNA: n stabiloimiseksi, siirtämiseksi RNA hiljennyksen ulottumattomiin ja viemiseksi polysomeille virusproteiinisynteesiä varten. Seuraavassa osajulkaisussa tutkittiin PVA infektioissa useisiin tehtäviin osallistuvan kuoriproteiinin (CP:n) laajamittaiseen kertymiseen vaikuttavia mekanismeja. CP määrän kontrollointi infektiovaiheen vaatimalla tavalla on välttämätöntä. Tiedetään, että korkeat CP määrät tukahduttavat potyviruksen geeniekspression. Siksi isäntäkasvin hajoitussysteemi pitää CP konsentraation matalana viruksen aktiivisen geeniekspression aikana infektion alussa. Myöhemmin infektion edettyä, CP:a tarvitaan suuria määriä viruspartikkeleiden runsaaseen tuottoon. Tutkimuksessa näytettiin, että VPg:n ylimäärä edistää reportteriproteiinin ilmentymistä huomattavasti enemmän silloin, kun se tuotetaan virusgenomin 3’ pään puolelta kuin 5’ puolelta. Samankaltainen ilmiö havaittiin infektion loppua kohden, kun CP:tä ja reportteriproteiinia tuotettiin 3’pään kistroneista voimakkaammin, kuin CI-proteiinia genomin keskellä olevasta kistronista tai reportteriproteiinia genomin 5’ puolella olevasta kistronista. Genomin 3’ puolelta CP:n ja reportteriproteiinin tuoton tai akkumulaation dynamiikka oli siis erilaista kuin muista osista PVA genomia. VPg:n ylimäärä saa aikaan CP:n ilmentymistason kasvua sekä infektion alussa, että lopussa. Siksi on mahdollista, että sen prosessin, jonka avulla partikkeleiden muodostukseen tarvittava CP:n määrä saavutetaan, mekanismi liittyy VPg:n määrän säätelyyn. Tämän väitöskirjan kolmannessa osatyössä tutkittiin, tarvitaanko CP:n stabilsoitumista onnistuneeseen partikkelin tuottoon. Työn tulokset paljastivat, että PVA:n HCPro osallistuu CP:n stabilomiseen ja virionin muodostukseen. HCPro ei kuitenkaan pystynyt stabiloimaan CP:tä itsenäisesti ilman virusinfektiota. Lisäksi, stabiilien partikkeleiden muodostus vaatii monia muitakin isäntäkasvin ja viruksen tekijöitä. HCPro:n stabilioiva vaikutus CP:in ei liity HCPro:n geenihiljennyksen tukahduttajana toimimiseen. Siksi stabilointitehtävää ei voitu komplementoida muiden virusten geenihiljennyksen tukahduttajaproteiinien avulla. Yhteenvetona, tässä väitöskirjassa kuvatut molekulaariset mekanismit toimivat joko potyvirusten resessiivisen resistenssin taustalla tai vaikuttavat normaaliin stabiilien viruspartikkeleiden muodostumiseen

Partially disordered structure in intravirus coat protein of potyvirus potato virus A.

Potyviruses represent the most biologically successful group of plant viruses, but to our knowledge, this work is the first detailed study of physicochemical characteristics of potyvirus virions. We measured the UV absorption, far and near UV circular dichroism spectra, intrinsic fluorescence spectra, and differential scanning calorimetry (DSC) melting curves of intact particles of a potato virus A (PVA). PVA virions proved to have a peculiar combination of physicochemical properties. The intravirus coat protein (CP) subunits were shown to contain an unusually high fraction of disordered structures, whereas PVA virions had an almost normal thermal stability. Upon heating from 20 °C to 55 °C, the fraction of disordered structures in the intravirus CP further increased, while PVA virions remained intact at up to 55 °C, after which their disruption (and DSC melting) started. We suggest that the structure of PVA virions below 55 °C is stabilized by interactions between the remaining structured segments of intravirus CP. It is not improbable that the biological efficiency of PVA relies on the disordered structure of intravirus CP

Heating-induced transition of Potyvirus Potato Virus A coat protein into β-structure

<div><p>In our previous communication, we have reported that virions of plant Potyvirus Potato Virus A (PVA) have a peculiar structure characterized by high content of disordered regions in intravirus coat protein (CP). In this report, we describe unusual properties of the PVA CP. With the help of a number of physicochemical methods, we have observed that the PVA CP just released from the virions by heating at 60–70 °C undergoes association into oligomers and transition to β- (and even cross-β-) conformation. Transition to β-structure on heating has been recently reported for a number of viral and non-viral proteins. The PVA CP isolated by LiCl method was also transformed into cross-β-structure on heating to 60 °C. Using the algorithms for protein aggregation prediction, we found that the aggregation-prone segments should be located in the central region of a PVA CP molecule. Possibly this transition mimics some functions of PVA CP in the virus life cycle in infected plants.</p></div