Epidemiología molecular y genómica comparativa de Leptospira spp. en Argentina

Tesis para obtener el grado de Doctora en el área de Ciencias Biológicas, de la Universidad de Buenos Aires, en 2015La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Leptospira y constituye una zoonosis de amplia distribución mundial. La enfermedad puede ser contraída a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la principal vía de transmisión es el agua. Los brotes de leptospirosis en Argentina están asociados a cambios climáticos y en particular a inundaciones. A pesar de ello, en nuestro país existe escasa información de la situación epidemiológica actual de la enfermedad, principalmente debido a la subnotificación de casos y a su persistencia de tipo endémico en los animales. En los últimos años se han reforzado los análisis tendientes al conocimiento epidemiológico de esta enfermedad. En el campo de la epidemiología molecular, se desarrollaron distintos enfoques basados en PCR para la identificación y tipificación de aislamientos de Leptospira, siendo las más utilizadas: MLVA (análisis de VNTRs en múltiples loci) y MLST (tipificación por secuenciación de múltiples loci). Ambas tecnologías se basan en la amplificación por PCR, con la diferencia de que en el primer caso se trata de elementos de tipo minisatélite (unidades repetitivas en un rango de 8 a 100 pares de bases) y en el segundo caso los blancos de amplificación constituyen fragmentos de genes conservados o housekeeping que son secuenciados para su posterior análisis. Esta última se ha convertido en una técnica líder entre los métodos de tipificación molecular, debido a su alto poder discriminatorio entre distintos aislamientos bacterianos, su fácil aplicación y estandarización, además de la posibilidad de transmitir la información obtenida en distintos laboratorios a través de bases de datos públicas. Asimismo, las secuencias génicas obtenidas son aplicables a estudios poblacionales y epidemiológicos. En este trabajo se evaluaron y desarrollaron los principales métodos para la tipificación de Leptospira; la evaluación y aplicación de las técnicas MLVA y MLST permitieron identificar genotipos circulantes de manera mayoritaria entre aislamientos argentinos, tanto provenientes de animales de producción como en humanos. Se logró generar un nuevo esquema de MLST (7LA) para leptospiras patógenas a partir de la combinación de dos esquemas existentes, optimizando y unificando la metodología de tipificación. Las secuencias génicas generadas en este trabajo se encuentran publicadas en una base de datos disponible en internet (http://pubmlst.org/leptospira/), donde además de acceder a las mismas, puede aplicarse la metodología para la determinación de genotipos a partir de nuevos aislamientos, posibilitando la comparación de cepas a nivel mundial. El nuevo esquema se aplicó no solamente a los aislamientos argentinos, sino que se utilizó en la tipificación in silico a partir de 283 secuencias genómicas de aislamientos y cepas de referencias mundiales que fueron generadas en el marco de un proyecto de secuenciación genómica de este género. Se establecieron 199 genotipos diferentes donde el perfil de MLST denominado ST47 agrupó el 34 % de los aislamientos estudiados, similarmente a lo ocurrido para las muestras argentinas. Como consecuencia de los análisis filogenéticos y de formación de complejos clonales, se logró establecer una correlación entre genotipos y serogrupos al que pertenecen los aislamientos, aportando de esta manera una alternativa complementaria al diagnóstico serológico actual. En este sentido, se logró también la generación de un esquema de MLST reducido utilizando tan sólo tres de los siete marcadores del esquema 7LA. El esquema reducido (3LA) permitió la tipificación molecular directamente a partir de muestras clínicas, sin necesidad de contar con el aislamiento, que muchas veces es sumamente difícil de lograr debido a las características propias de esta bacteria. Este trabajo permitió entonces profundizar en el conocimiento de la variabilidad genética del género Leptospira y así generar información epidemiológica adecuada que pueda ser utilizada en programas de control y métodos de diagnóstico de esta enfermedad, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país.Leptospirosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Leptospira, and constitutes a zoonosis of worldwide distribution. The water becomes the main route of transmission when it is contaminated by the urine of infected animals. The outbreaks of leptospirosis in Argentina are associated to climate changes and particularly to the occurrence of floods. However, there is little information on the current epidemiological situation of the disease in our country, mainly due to underreported cases and the persistence of endemicity in animals. Recently, epidemiological analyses have strengthened the understanding of this disease. In the field of molecular epidemiology, PCR-based approaches for the identification and typing of isolates of Leptospira have been developed. Currently, the most frequently used approaches are MLVA (Multiple Locus VNTRs Analysis) and MLST (Multilocus Sequence Typing). Both technologies are based on PCR amplification. However, for MLVA the amplification targets are minisatellite elements (repeats in a range of 8 to 100 base pairs), whereas MLST targets fragments of housekeeping genes that are sequenced for further analysis. MLST has become a leading technique among the molecular typing methods, because of its high discriminatory power between different bacterial isolates, easy application and standardization, plus the ability to share information obtained in different laboratories through public databases. Besides, the gene sequences generated by this method area applicable to population and epidemiological studies. In this work, we evaluated and developed the main methods for typing Leptospira. The implementation of MLVA and MLST techniques led to the identification of major genotypes circulating among Argentine isolates from both livestock and humans. A new MLST scheme (7LA) was generated for pathogenic leptospires by optimizing and unifying two pre-existing MLST strategies. The gene sequences generated through this work have been published in a database available online (http://pubmlst.org/leptospira/). The methodology can also be applied for the genotyping of new isolates, enabling the comparison of genotypes worldwide. In addition, the new scheme was applied not only to Argentine isolates, but was used in silico for the characterization of 283 genomic sequences of isolates and strains of global distribution, which were generated as part of a genome sequencing project dedicated to this genus. A total of 199 different genotypes were established, and the MLST allelic profile named ST47 grouped 34% of the studied isolates, in agreement with the previous studies on Argentine samples. As a result of the phylogenetic and clonal complexes analyses, we could establish a correlation between genotypes and serogroups, thus providing a complementary alternative to the current serological diagnosis. In this regard, the generation of a reduced MLST scheme was also achieved, by selecting only three of the seven markers from the 7LA scheme. The reduced MLST scheme (3LA) was applied to the molecular typing from clinical sample without the need of isolation, which is often difficult to achieve because of the particular characteristics of this bacterium. In summary, this work allowed us to deepen the understanding of the genetic variability of the genus Leptospira, thus contributing with suitable epidemiologic information useful to apply in the design of control strategies and also diagnostic methods for this illness. Thus, this study constitutes the first work of its kind conducted in our country.Instituto de BiotecnologíaFil: Varni, Vanina Delia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina

Occupancy of avian foraging guilds in soybean fields and borders in Entre Ríos, Argentina: responses to vegetation structure and prey resources

Reconciling agriculture and biodiversity conservation is a challenge given the growing demand for agricultural products. In recent decades, Argentina has witnessed agricultural expansion and intensification affecting biodiversity and associated ecosystem services. Within agroecosystems, the level of habitat quality is critical for birds, and may depend on vegetation structure, availability of invertebrate prey, and the use of pesticides. Although the relationship between vegetation structure and avian occurrence has been widely studied, to our knowledge, there are no studies that also incorporate prey availability throughout the cycle of soybean crops in Argentina. We estimated and predicted the effects of land cover and temporal variation on the occurrence of avian foraging guilds in Entre Ríos, Argentina, in order to guide management related to potential ecosystem services provided by birds. We also estimated temporal effects of vegetation structure and insecticides on the main arthropod orders consumed by birds to evaluate prey availability. Methods: We conducted bird and arthropod surveys for 2 years along transects located in 20 randomly selected soybean fields (N = 60) and their adjacent borders (N = 78) throughout the crop growing season, in four seasons. We estimated avian occupancy, accounting for imperfect detection, and arthropod counts fitting generalized linear mixed models. Results: The number of native trees in field borders positively influenced the occurrence of most bird species, mainly insectivores. Granivore foliage gleaners, also were positively affected by grass height. Salliers and aerial foragers were weakly affected by distance to forest and native trees. In general, the availability of invertebrates to birds was highest during the third season. Arthropod counts in borders were greater during the last three crop stages than during the pre-sowing period. Conclusions: We found that with 10 to 15 native tree species in borders, coupled with a complex vegetation structure with shrubs and grasses, we could conserve a wide spectrum of insectivorous birds, and may contribute to the invertebrate pest control service. Vegetated field borders function as a refuge for arthropods, especially agriculturally beneficial taxa such as Hymenopterans. Finally, several groups of birds use the interior of the fields and could help control pests.Instituto de Recursos BiológicosFil: Goijman, Andrea Paula. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Recursos Biológicos; Argentina. University of Georgia. D.B. Warnell School of Forestry and Natural Resources; Estados UnidosFil: Conroy, Michael J. University of Georgia. D.B. Warnell School of Forestry and Natural Resources; Estados UnidosFil: Varni, Vanina Delia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Recursos Biológicos; ArgentinaFil: Thompson, Jeffrey. Guyra Paraguay – CONACYT; Paraguay. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Recursos Biológicos; Argentina.Fil: Zaccagnini, Maria Elena. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Recursos Biológicos; Argentin

A combined approach of VNTR and MLST analysis: Improvement of molecular typing of argentinean isolates of Leptospira interrogans

Leptospirosis is an emerging infectious disease that has been identified as both a human and animal health problem worldwide. Regular outbreaks associated with specific risk factors have been reported in Argentina. However, there are no available data concerning the genetic population level for this pathogen. Therefore, the aim of this work was to describe the genetic diversity of Leptospira interrogans through the application of two molecular typing strategies: variable number of tandem repeats (VNTR) and multilocus sequence typing (MLST). For this purpose, seven reference strains and 18 non-epidemiologically related isolates from diverse hosts and Argentinean regions were analysed. Among them, nine genotypes and seven sequence types (STs), including three unreported STs, were described using VNTR and MLST, respectively. eBURST analysis demonstrated that ST37 was the most frequent and founder genotype of a clonal complex (CCs) containing STN1 and STN3, suggesting the importance of studying the serovars belonging to this CC in Argentina. The data from maximum parsimony analysis, which combined both techniques, achieved intra-serovar discrimination, surmounted microscopic agglutination test discrepancies and increased the discriminatory power of each technique applied separately. This study is the first to combine both strategies for L. interrogans typing to generate a more comprehensive molecular genotyping of isolates from Argentina in a global context.Fil: Caimi, Karina Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Varni, Vanina Delia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Meléndez, Yamil Nazareno. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Koval, Ariel. Biogénesis Bagó; ArgentinaFil: Brihuega, Bibiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Patobiología; ArgentinaFil: Ruybal, Paula. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

A combined approach of VNTR and MLST analysis: Improvement of molecular typing of argentinean isolates of Leptospira interrogans

Leptospirosis is an emerging infectious disease that has been identified as both a human and animal health problem worldwide. Regular outbreaks associated with specific risk factors have been reported in Argentina. However, there are no available data concerning the genetic population level for this pathogen. Therefore, the aim of this work was to describe the genetic diversity of Leptospira interrogans through the application of two molecular typing strategies: variable number of tandem repeats (VNTR) and multilocus sequence typing (MLST). For this purpose, seven reference strains and 18 non-epidemiologically related isolates from diverse hosts and Argentinean regions were analysed. Among them, nine genotypes and seven sequence types (STs), including three unreported STs, were described using VNTR and MLST, respectively. eBURST analysis demonstrated that ST37 was the most frequent and founder genotype of a clonal complex (CCs) containing STN1 and STN3, suggesting the importance of studying the serovars belonging to this CC in Argentina. The data from maximum parsimony analysis, which combined both techniques, achieved intra-serovar discrimination, surmounted microscopic agglutination test discrepancies and increased the discriminatory power of each technique applied separately. This study is the first to combine both strategies for L. interrogans typing to generate a more comprehensive molecular genotyping of isolates from Argentina in a global context.Fil: Caimi, Karina Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Varni, Vanina Delia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Meléndez, Yamil Nazareno. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Koval, Ariel. Biogénesis Bagó; ArgentinaFil: Brihuega, Bibiana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Patobiología; ArgentinaFil: Ruybal, Paula. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Desarrollo de inmunocromatografías para el diagnóstico de leptospirosis y neosporosis bovina

Los abortos en el ganado bovino implican pérdidas económicas en la industria pecuaria; los agentes infecciosos son una de las principales causas asociadas. Entre las diversas enfermedades identificadas en nuestro país como responsables de abortos en bovinos, la neosporosis y la leptospirosis adquieren suma importancia no solo debido a las pérdidas económicas aparejadas, sino, también, en el caso de esta última, al riesgo que implica para la salud pública. El diagnóstico de ambas enfermedades se basa en métodos serológicos que requieren de la producción de antígenos a partir de cultivos bacterianos y parasitarios, respectivamente, y, a su vez, de sistemas de detección o revelado solamente presentes en laboratorios de referencia. En este proyecto, se propone el desarrollo de dos pruebas de inmunocromatografía lateral para el diagnóstico de Leptospira sp. y Neospora caninum. Ambos test estarán basados en antígenos recombinantes y podrán ser utilizados a campo sin requerir de ningún equipamiento sofisticado para su lectura. Además de contar con el nuevo desarrollo diagnóstico, este proyecto permitirá obtener información sobre la prevalencia de estas infecciones veterinarias y establecer la situación epidemiológica de la leptospirosis y la neosporosis bovinas en diferentes áreas geográficas de nuestro país.Abortions in cattle are a major source of economic losses in the livestock industry. Infectious agents are one of the main associated causes. Among the diseases identified as responsible for abortions in cattle in our country, neosporosis and leptospirosis acquire importance, because of the rigged economic losses, and also for the risk involved to public health in case of leptospirosis. Diagnosis of both diseases is currently based on serological methods that require the production of bacterial and parasitic antigens and at the same time, special equipment present just at reference laboratories, which make it unsuitable for clinical or field applications. For these reasons this project proposes the development of an immunochromatography test with high sensitivity and specificity based on recombinant antigens for diagnosis of Leptospira sp. and Neospora caninum. This test that does not require any instrument, would be extremely valuable for use in clinical and field applications for the diagnosis of both diseases. In addition to the new diagnostic development, this project will provide information on the prevalence of these infections and will establish the veterinary epidemiological situation of bovine Leptospirosis and Neosporosis in different geographic areas of Argentina.Inst. de BiotecnologíaFil: Montenegro, Valeria Noely. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología. Laboratorio de Hemoparásitos; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Varni, Vanina Delia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología. Laboratorio de Hemoparásitos; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Nagel, Ariel Gaston. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología. Laboratorio de Hemoparásitos; Argentina. Fondo para la Investigación Científica y Tecnológica; ArgentinaFil: Jaramillo Ortiz, Jose Manuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología. Laboratorio de Hemoparásitos; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Paoletta, MartinaInstituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología. Laboratorio de Hemoparásitos; ArgentinaFil: de la Fourniere, Sofía Ana María. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Rectorado. Instituto de Investigaciones en Salud Pública; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Moore, Prando Dadin. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Brihuega, Bibiana Felicitas. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Patobiología; ArgentinaFil: Caimi, Karina Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Development of an immunocromathography for bovine leptospirosis and neosporosis diagnosis

Los abortos en el ganado bovino implican pérdidas económicas en la industria pecuaria; los agentes infecciosos son una de las principales causas asociadas. Entre las diversas enfermedades identificadas en nuestro país como responsables de abortos en bovinos, la neosporosis y la leptospirosis adquieren suma importancia no solo debido a las pérdidas económicas aparejadas, sino, también, en el caso de esta última, al riesgo que implica para la salud pública.El diagnóstico de ambas enfermedades se basa en métodos serológicos que requieren de la producción de antígenos a partir de cultivos bacterianos y parasitarios, respectivamente, y, a su vez, de sistemas de detección o revelado solamente presentes en laboratorios de referencia.En este proyecto, se propone el desarrollo de dos pruebas de inmunocromatografía lateral para el diagnóstico de Leptospira sp. y Neospora caninum. Ambos test estarán basados en antígenos recombinantes y podrán ser utilizados a campo sin requerir de ningún equipamiento sofisticado para su lectura. Además de contar con el nuevo desarrollo diagnóstico, este proyecto permitirá obtener información sobre la prevalencia de estas infecciones veterinarias y establecer la situación epidemiológica de la leptospirosis y la neosporosis bovinas en diferentes áreas geográficas de nuestro país..Abortions in cattle are a major source of economic losses in the livestock industry. Infectious agents are one of the main associated causes. Among the diseases identified as responsible for abortions in cattle in our country, neosporosis and leptospirosis acquire importance, because of the rigged economic losses, and also for the risk involved to public health in case of leptospirosis.Diagnosis of both diseases is currently based on serological methods that require the production of bacterial and parasitic antigens and at the same time, special equipment present just at reference laboratories, which make it unsuitable for clinical or field applications.For these reasons this project proposes the development of an immunochromatography test with high sensitivity and specificity based on recombinant antigens for diagnosis of Leptospira sp. and Neospora caninum.This test that does not require any instrument, would be extremely valuable for use in clinical and field applications for the diagnosis of both diseases. In addition to the new diagnostic development, this project will provide information on the prevalence of these infections and will establish the veterinary epidemiological situation of bovine Leptospirosis and Neosporosis in different geographic areas of Argentina.Fil: Montenegro, Valeria Noely. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Varni, Vanina Delia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Nagel, Ariel Gastón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Jaramillo Ortiz, José Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Paoletta, Martina Soledad. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: de la Fourniere, Sofía Ana María. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Macoretta, Christian Leandro. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Moore, Dadin Prando. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro Regional Buenos Aires Sur. Estación Experimental Agropecuaria Balcarce; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Brihuega, Bibiana. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Patobiología; ArgentinaFil: Caimi, Karina Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Wilkowsky, Silvina Elizabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentin

Molecular epidemiology and comparative genomics of Leptospira spp. in Argentina

La leptospirosis es una enfermedad infecciosa causada por bacterias del género Leptospira y constituye una zoonosis de amplia distribución mundial. La enfermedad puede ser contraída a través del contacto con ambientes contaminados con orina de animales infectados, donde la principal vía de transmisión es el agua. Los brotes de leptospirosis en Argentina están asociados a cambios climáticos y en particular a inundaciones. A pesar de ello, en nuestro país existe escasa información de la situación epidemiológica actual de la enfermedad, principalmente debido a la subnotificación de casos y a su persistencia de tipo endémico en los animales. En los últimos años se han reforzado los análisis tendientes al conocimiento epidemiológico de esta enfermedad. En el campo de la epidemiología molecular, se desarrollaron distintos enfoques basados en PCR para la identificación y tipificación de aislamientos de Leptospira, siendo las más utilizadas: MLVA (análisis de VNTRs en múltiples loci) y MLST (tipificación por secuenciación de múltiples loci). Ambas tecnologías se basan en la amplificación por PCR, con la diferencia de que en el primer caso se trata de elementos de tipo minisatélite (unidades repetitivas en un rango de 8 a 100 pares de bases) y en el segundo caso los blancos de amplificación constituyen fragmentos de genes conservados o housekeeping que son secuenciados para su posterior análisis. Esta última se ha convertido en una técnica líder entre los métodos de tipificación molecular, debido a su alto poder discriminatorio entre distintos aislamientos bacterianos, su fácil aplicación y estandarización, además de la posibilidad de transmitir la información obtenida en distintos laboratorios a través de bases de datos públicas. Asimismo, las secuencias génicas obtenidas son aplicables a estudios poblacionales y epidemiológicos. En este trabajo se evaluaron y desarrollaron los principales métodos para la tipificación de Leptospira; la evaluación y aplicación de las técnicas MLVA y MLST permitieron identificar genotipos circulantes de manera mayoritaria entre aislamientos argentinos, tanto provenientes de animales de producción como en humanos. Se logró generar un nuevo esquema de MLST (7LA) para leptospiras patógenas a partir de la combinación de dos esquemas existentes, optimizando y unificando la metodología de tipificación. Las secuencias génicas generadas en este trabajo se encuentran publicadas en una base de datos disponible en internet (http://pubmlst.org/leptospira/), donde además de acceder a las mismas, puede aplicarse la metodología para la determinación de genotipos a partir de nuevos aislamientos, posibilitando la comparación de cepas a nivel mundial. El nuevo esquema se aplicó no solamente a los aislamientos argentinos, sino que se utilizó en la tipificación in silico a partir de 283 secuencias genómicas de aislamientos y cepas de referencias mundiales que fueron generadas en el marco de un proyecto de secuenciación genómica de este género. Se establecieron 199 genotipos diferentes donde el perfil de MLST denominado ST47 agrupó el 34 % de los aislamientos estudiados, similarmente a lo ocurrido para las muestras argentinas. Como consecuencia de los análisis filogenéticos y de formación de complejos clonales, se logró establecer una correlación entre genotipos y serogrupos al que pertenecen los aislamientos, aportando de esta manera una alternativa complementaria al diagnóstico serológico actual. En este sentido, se logró también la generación de un esquema de MLST reducido utilizando tan sólo tres de los siete marcadores del esquema 7LA. El esquema reducido (3LA) permitió la tipificación molecular directamente a partir de muestras clínicas, sin necesidad de contar con el aislamiento, que muchas veces es sumamente difícil de lograr debido a las características propias de esta bacteria. Este trabajo permitió entonces profundizar en el conocimiento de la variabilidad genética del género Leptospira y así generar información epidemiológica adecuada que pueda ser utilizada en programas de control y métodos de diagnóstico de esta enfermedad, constituyendo el primer trabajo en su tipo realizado en nuestro país. PALABRAS CLAVE: Leptospira, epidemiología, Multilocus Sequence Typing, serogrupos, genotipos, diversidad genética.Leptospirosis is an infectious disease caused by bacteria of the genus Leptospira, and constitutes a zoonosis of worldwide distribution. The water becomes the main route of transmission when it is contaminated by the urine of infected animals. The outbreaks of leptospirosis in Argentina are associated to climate changes and particularly to the occurrence of floods. However, there is little information on the current epidemiological situation of the disease in our country, mainly due to underreported cases and the persistence of endemicity in animals. Recently, epidemiological analyses have strengthened the understanding of this disease. In the field of molecular epidemiology, PCR-based approaches for the identification and typing of isolates of Leptospira have been developed. Currently, the most frequently used approaches are MLVA (Multiple Locus VNTRs Analysis) and MLST (Multilocus Sequence Typing). Both technologies are based on PCR amplification. However, for MLVA the amplification targets are minisatellite elements (repeats in a range of 8 to 100 base pairs), whereas MLST targets fragments of housekeeping genes that are sequenced for further analysis. MLST has become a leading technique among the molecular typing methods, because of its high discriminatory power between different bacterial isolates, easy application and standardization, plus the ability to share information obtained in different laboratories through public databases. Besides, the gene sequences generated by this method area applicable to population and epidemiological studies. In this work, we evaluated and developed the main methods for typing Leptospira. The implementation of MLVA and MLST techniques led to the identification of major genotypes circulating among Argentine isolates from both livestock and humans. A new MLST scheme (7LA) was generated for pathogenic leptospires by optimizing and unifying two pre-existing MLST strategies. The gene sequences generated through this work have been published in a database available online (http://pubmlst.org/leptospira/). The methodology can also be applied for the genotyping of new isolates, enabling the comparison of genotypes worldwide. In addition, the new scheme was applied not only to Argentine isolates, but was used in silico for the characterization of 283 genomic sequences of isolates and strains of global distribution, which were generated as part of a genome sequencing project dedicated to this genus. A total of 199 different genotypes were established, and the MLST allelic profile named ST47 grouped 34% of the studied isolates, in agreement with the previous studies on Argentine samples. As a result of the phylogenetic and clonal complexes analyses, we could establish a correlation between genotypes and serogroups, thus providing a complementary alternative to the current serological diagnosis. In this regard, the generation of a reduced MLST scheme was also achieved, by selecting only three of the seven markers from the 7LA scheme. The reduced MLST scheme (3LA) was applied to the molecular typing from clinical sample without the need of isolation, which is often difficult to achieve because of the particular characteristics of this bacterium. In summary, this work allowed us to deepen the understanding of the genetic variability of the genus Leptospira, thus contributing with suitable epidemiologic information useful to apply in the design of control strategies and also diagnostic methods for this illness. Thus, this study constitutes the first work of its kind conducted in our country. KEYWORDS: Leptospira, epidemiology, Multilocus Sequence Typing, serogroups, genotypes, genetic diversity.Fil:Varni, Vanina Delia. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina

Leptospira species molecular epidemiology in the genomic era

Leptospirosis is a zoonotic disease which global burden is increasing often related to climatic change. Hundreds of whole genome sequences from worldwide isolates of Leptospira spp. are available nowadays, together with online tools that permit to assign MLST sequence types (STs) directly from raw sequence data. In this work we have applied R7L-MLST to near 500 genomes and strains collection globally distributed. All 10 pathogenic species as well as intermediate were typed using this MLST scheme. The correlation observed between STs and serogroups in our previous work, is still satisfied with this higher dataset sustaining the implementation of MLST to assist serological classification as a complementary approach. Bayesian phylogenetic analysis of concatenated sequences from R7-MLST loci allowed us to resolve taxonomic inconsistencies but also showed that events such as recombination, gene conversion or lateral gene transfer played an important role in the evolution of Leptospira genus. Whole genome sequencing allows us to contribute with suitable epidemiologic information useful to apply in the design of control strategies and also in diagnostic methods for this illness.Fil: Caimi, Karina Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; ArgentinaFil: Repetto, Silvia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Varni, Vanina Delia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria; ArgentinaFil: Ruybal, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; Argentin

Simplified MLST scheme for direct typing of Leptospira human clinical samples

Leptospirosis is a globally distributed zoonosis. Epidemiological data are scarce and present major challenge because of the varied clinical presentations. Multilocus Sequence Typing has already proven to be a robust molecular typing method providing accurate results for strain characterization. We have adapted our MLST scheme by reducing the set of loci to facilitate Leptospira typing directly from human clinical samples. The application of this 3-locus scheme provides Leptospira species and allelic profiles of the samples retaining the power of discrimination of the whole scheme. Moreover, an approach to the serogroups was also achieved. Our results contribute to the epidemiological study of Leptospirosis, since the direct typing on clinical specimens could detect and update allelic variants and serogroups present in a region. The simplified scheme allowed at the same time to take advantage of limited genetic material available in clinical samples that may increase the sources of information for epidemiological monitoring.Fil: Varni, Vanina Delia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Chiani, Yosena. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorios e Instituto de Salud "Dr. C. G. Malbran". Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias; ArgentinaFil: Nagel, Ariel Gastón. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Ruybal, Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Vanasco, Norma Bibiana. Dirección Nacional de Instituto de Investigación. Administración Nacional de Laboratorios e Instituto de Salud "Dr. C. G. Malbran". Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias; ArgentinaFil: Caimi, Karina Cynthia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Biotecnología; Argentin

First Genome Sequence of Leptospira interrogans Serovar Pomona, Isolated from a Bovine Abortion

Leptospirosis is a widespread zoonosis and a re-emergent disease of global distribution with major relevance in veterinary pro- duction. Here, we report the whole-genome sequence of Leptospira interrogans serovar Pomona strain AKRFB, isolated from a bovine abortion during a leptospirosis outbreak in ArgentinaEEA RafaelaFil: Varni, Vanina Delia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Koval, Ariel. Biogenesis Bagó; ArgentinaFil: Nagel, Ariel Gaston. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; ArgentinaFil: Ruybal, Paula. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Microbiología y Parasitología Médica; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Caimi, Karina Cynthia. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Amadio, Ariel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin