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Caracterizaci贸n molecular del reflejo inflamatorio y modulaci贸n de la respuesta inmune frente a infecciones en peces
El mantenimiento de la homeostasis del sistema inmune innato es fundamental, ya que 茅ste debe mantener una respuesta equilibrada frente a los pat贸genos. En mam铆feros, uno de los mecanismos por el cual se mantiene la homeostasis es el reflejo inflamatorio, un circuito neural que modula la respuesta inflamatoria previniendo la posibilidad de una sobreactivaci贸n. El primer objetivo de esta tesis fue establecer si el reflejo inflamatorio descrito en mam铆feros tambi茅n estaba presente en otros vertebrados, y para ello nos centramos en su estudio en tele贸steos, m谩s espec铆ficamente en trucha (Oncorhynchus mykiss). Una pieza clave del sistema del reflejo inflamatorio es el receptor nicot铆nico de acetilcolina alfa 7 (伪7nAChR). La secuencia del receptor 伪7nACh de trucha est谩 altamente conservada en comparaci贸n con otras especies y el an谩lisis filogen茅tico lo agrupa con otras especies de peces. En estudios in vivo, la estimulaci贸n intraperitoneal con lipopolisac谩rido (LPS) y un an谩logo del ARN de doble cadena (poly (I:C)), aumentan la expresi贸n del receptor 伪7nACh en diferentes tejidos y, adem谩s, modulan los niveles de acetilcolina en plasma y en bazo. Adicionalmente, el receptor se expresa en macr贸fagos aislados de bazo y de ri帽贸n anterior, en ambos casos siendo capaz de unir 伪-bungarotoxina, un antagonista espec铆fico del receptor 伪7nACh. Nuestros resultados muestran que existe una modulaci贸n de la nicotina (un agonista del receptor) en la expresi贸n g茅nica de mol茅culas inflamatorias en macr贸fagos frente a una estimulaci贸n con poly (I:C) y no con LPS, a diferencia de estudios realizados en mam铆feros. Esta modulaci贸n se realiza a trav茅s del receptor 伪7nACh, ya que la adici贸n de un antagonista espec铆fico, produce una disminuci贸n del efecto de la nicotina. En conclusi贸n, los resultados presentados otorgan indicios de la existencia de un sistema de reflejo inflamatorio en peces, con similitudes y diferencias con el sistema descrito en mam铆feros.
La mayor铆a de los tele贸steos responden a los pat贸genos con un potente sistema inmune innato, lo que convierte la modulaci贸n de 茅ste, en una buena herramienta para mejorar la capacidad de respuesta de los peces ante una infecci贸n. El sistema inmune de los tele贸steos puede ser estimulado a trav茅s de patrones moleculares asociados a pat贸genos (PAMPs), y a su vez, por citoquinas, como potenciadores no espec铆ficos. La segunda hip贸tesis de esta tesis es que nanopart铆culas proteicas, conocidas como cuerpos de inclusi贸n (CI), pueden ser utilizados como plataformas de entrega de inmunoestimulantes. En este contexto, fueron desarrollados CI con (citoquinas) y sin (prote铆nas fluorescentes) una funci贸n inmunol贸gica en peces. Los CI son internalizados in vitro por hepatocitos del pez cebra (Danio rerio) y por macr贸fagos de trucha, modulando la expresi贸n g茅nica de genes relacionados con la respuesta inflamatoria. Los resultados de la biodistribuci贸n in vivo en trucha mostraron que los CI son acumulados en bazo y en ri帽贸n anterior, y son endocitados por c茅lulas inmunes relevantes como, los macr贸fagos. Los diferentes
CI producidos y administrados intraperitonealmente, protegen al pez cebra frente a una infecci贸n bacteriana letal (Pseudomonas aeruginosa), siendo mayor la protecci贸n otorgada por los CI formados por citoquinas. Adicionalmente, los CI mantienen su morfolog铆a y funci贸n frente a condiciones extremas de pH y temperatura, as铆 como durante la liofilizaci贸n. Al ser administrados oralmente en truchas, los CI llegan a los dos primeros tramos del intestino y son absorbidos por c茅lulas presentes en la mucosa intestinal, las cuales, por su localizaci贸n en la mucosa podr铆an corresponderse con linfocitos intraepiteliales (IELs). Nuestros resultados sugieren que los CI pueden ser una alternativa a los m茅todos actuales como plataforma de entrega de inmunoestimulantes y prote铆nas por v铆a oral sin necesidad de encapsulaci贸n adicional, siendo 茅ste uno de los principales objetivos de la industria de cultivo de peces.The inflammatory reflex is a neural circuit that modulates the innate immune system response preventing an overactivation. The first hypothesis of this thesis was to establish whether the inflammatory reflex described in mammals was also present in other vertebrates, and we focused on its study in Oncorhynchus mykiss. We cloned and characterised one of the main components of the inflammatory reflex: the alpha 7 nicotinic acetylcholine receptor (伪7nAChR). The in vivo stimulation with LPS and poly (I:C) increased the receptor gene expression in different tissues and, also, modulated acetylcholine levels in plasma and spleen. The receptor was expressed in trout macrophages and was able to bind bungarotoxin, a specific receptor antagonist. Our results showed that nicotine modulates the gene expression of inflammatory genes in macrophages through 伪7nAChR after the stimulation with poly (I:C). In conclusion, the results provide evidences of evolutionary conservation of the inflammatory reflex in vertebrates.
Teleost respond to an infections with the activation of a potent innate immune system aiming to eliminate pathogens. Thus, the modulation of the innate system would be an excellent target to improve the responsiveness of the fish to an infection. We have been used protein nanoparticles, known as inclusion bodies (IBs) as immunostimulants delivery platform. The IBs were efficiently internalized in vitro by both zebrafish hepatocytes (Danio rerio) and trout macrophages, and when IBs were administered in vivo they accumulated in the spleen and the head kidney of trout. Importantly, the IBs administered by intraperitoneal injection protect zebrafish against a lethal bacterial infection (Pseudomonas aeruginosa). The orally administered IBs were uptaken by cells of the intestinal mucosa. Our results suggest that the IBs could be an attractive alternative to stimulation of the innate immune system and can be administered orally overcoming the harsh conditions of the gastrointestinal tract