Alternatív sejtelhalási mechanizmusok, mint a tumor ellenes terápia célpontjai = Alternative mechanisms of the cell death as targets for anti-tumor therapy

A daganatellenes kemoterápiában alakalmazott vegyületek egyik fontos hatása az, hogy daganatsejtekben aktív sejtelhalást váltanak ki. Az alternatív sejtelhalási típusok közül legismeretebb az apoptotikus és a nekrotikus forma, amelyeknek eltérő immunológiai következménye is vélelmezhető. Az apoptotikus jelpálya centrális elemei a kaszpáz proteázok. Azonban kaszpázaktivitás hiányában is (génexpressziós eltérések, oxidatív környezet) indukálódhat aktív sejtelhalás és fordítva: a kaszpázaktivitás nem jár együtt mindig sejtelhalással. Kutatásaink célja az volt, hogy olyan, elsősorban proteolitikus aktivitásokat azonosítsunk daganatsejtekben, amelyek helyettesíthetik a kaszpázok hiányát, illetve kaszpáz aktiválódás mellett is befolyásolják a sejtelhalást. Távlati célunk az, hogy ezeket a proteolitikus aktivitásokat megcélozva hatékonyabb daganatellenes terápiák lehetőségét alapozzunk meg. Eredményeink azt mutatják, hogy a cisztein katepszinek nem helyettesítik a kaszpázok apoptótikus funkcióját az általunk kidolgozott leukémia modellekben, de befolyásolhatják a kialakuló sejtelhalás típusát (apoptózis-nekrózis váltás). A proteaszóma aktivitás pro- és antiapoptotikus hatású is lehet kaszpáz-mediálta sejtelhaláskor függően az indukáló szerektől és sejttípustól. Kidolgoztunk egy új eljárást nekrotikus sejtek detektálására áramlásos citométerrel. | Induction of active cell death is the main effect of therapeutic anticancer drugs. The most known alternative cell death forms are apoptosis and necrosis that have also alternative immunological consequences. Caspase proteases are the central elements of the apoptotic pathway. However, in the absence of caspase activity (change in gene expression, oxidative environment) cell death can proceed and vica versa: caspase activation is not always accompanied with cell death. The purpose of our project was to identify proteolytic activities that may replace caspases in apoptosis or modulate the outcome of apoptotic process in the presence of caspase activation in cancer cells. Taking a long view, our aim is to target these proteolytic activities to improve the anticancer activities of therapeutic drugs. Our resuls demonstrated that cystein cathepsins do not substitute caspase activity in our leukemic models, but influence the emerging mode of cell death (apoptosis-necrosis switch). Proteasome activity can promote both pro- and anti-apoptotic effects in caspase-mediated cell death depending on inducer drugs and cell types. We have developed a new method to detect necrotic cells by flow cytometry

A kollagén XVII-felülreguláció, malignus transzformáció és tumorprogresszió kapcsolata melanomákban = Correlations between collagen XVII upregulation malignant transformation and tumor-progression in melanomas

A jó- és rosszindulatú melanocytás daganatok elkülöníthetése alapvető fontosságú. Elsőként figyeltük meg, hogy a karcinogenezisben is előforduló matrix-kötő kollagén XVII fehérje, aktivált melanocytákban és melanomákban is kimutatható. A pozitív reakció a sejthez kötött, aa507-529 régióra korlátozódik a matrix-kötő domén hiányzik. A reziduális domén primer és áttéti melanomákban, melanoma sejtvonalakban és atípusos dysplasticus naevus szigetekben termelődött, jóindulatú naevusokban nem. A kollagén XVII ligandjai a laminin-5 és kollagén IV is hiányoztak melanomákból. A kollagén XVII immunreakció átfedő profilt adott az S100, MelanA és HMB45 reakciókkal, de pozitív volt orsósejtes melanomában is. A kollagén XVII kifejeződés statisztikai összefüggött a melanoma proliferációval (emelkedett Ki67, ciklinD1 ill. eltűnő p16ink4 szintek), a daganatok vertikális növekedésével, a Breslow, ill. Clark szerinti terjedésével és az invazív dagantfronttal. A HT199 melanoma sejtvonal xenograftok szintén konstitutíven kifejezték a kollagén XVII fehérjét primer és áttéti lokalizációkban és keringő daganatsejtekben, az invazív sejtek emelkedett fehérjetermelésével. Az aa507-529 regiót célzó kollagén XVII immunterápia a melanoma proliferáció gátlása mellett fokozta az apoptózist és a sejtadhéziót. Összegezve, a kollagén XVII fehérje kifejeződése alkalmas a jó- és a rosszindulatú melanocytás léziók elkülönítésére, valamint az invazív fenotípus és antitest indukálta melanoma sejthalál közvetítésére. | Markers for differentiating malignant from benign melanocytic lesions are essential in melanoma diagnostics. We found collagen XVII, a matrix anchoring transmembrane protein which is upregulated in carcinogenesis, in activated melanocytes and malignant melanomas. The cell residual aa507-529 region but not the matrix-anchoring shedding ectodomain of collagen XVII was detected in primary and metastatic melanomas, melanoma cell lines and in atypical nests of dysplastic nevi, while melanocytic nevi were negative. The natural ligands of collagen XVII, laminin-5 and collagen IV were also missing from most melanomas. Collagen XVII immunoreaction stained spindle cell melanomas and showed partly overlapping profiles with those of S100, Melan-A and HMB45. Collagen XVII expression was statistically associated with melanoma proliferation (elevated Ki67 and cyclin D1 fractions and loss of p16ink4), Breslow thickness, Clark levels, vertical growth phase and invasive tumor fronts. Xenografts of HT199 melanoma cell line constitutively expressed collagen XVII in primary, metastatic and circulating tumor cells, and displayed elevated levels in invasive versus adherent cells in culture. Antibody targeting the aa507-529 region of collagen XVII promoted apoptosis and cell adhesion, while inhibiting proliferation of HT199 cells. Accordingly, collagen XVII protein expression can differentiate melanomas from benign nevi and mediate invasion and antibody induced death of melanoma cells

A spinalis izomatrophiát meghatározó survival motoneuron gének kvantitatív analízise = Quantitative analysis of the genes determining spinal muscular atrophy

Spinal muscular atrophy (SMA) is one of the most common autosomal recessive diseases, affecting approximately one in 10,000 live births and with a carrier frequency of approximately one in 35. The disease is caused by a deficiency of the ubiquitous protein survival of motor neuron (SMN), which is encoded by the SMN1 and SMN2 genes. Due to a single nucleotide polymorphism in exon 7, SMN2 produces less full-length transcript than SMN1 and cannot prevent neuronal cell death at physiologic gene dosages. On the other hand, the copy number of SMN2 affects the amount of SMN protein produced and the severity of the SMA phenotype. SMN gene dosage analysis can determine the copy number of SMN1 to detect carriers and patients heterozygous for the absence of SMN1 exon 7. This study provides copy number estimation of SMN1 gene by real-time PCR technique in 56 SMA type I., II., III. patients, 159 parents and healthy relatives and in 152 undefined SMA patients. Among the family members, 91 carriers have been detected and in 56 patients homozygous deletion of SMN1 exon 7 has been confirmed. Moreover, in 12 patients compound heterozygosity of SMN1 exon 7 mutation has been detected, thus providing the possible diagnosis of SMA. In 94 patients, copy number of SMN2 has also been evaluated and a good correlation has been found with the phenotype of the disease. Due to the genetic complexity and the high carrier frequency, accurate risk assessment and genetic counselling are particularly important for the families. These new results provide improvement of the diagnostic service in SMA in Hungary with focus on proper genetic counselling and possible enrolment of the patients in future therapeutic interventions

Izomdystrophiák differenciál-diagnosztikai vizsgálata molekuláris genetikai, valamint immunhisztokémiai és immunoblot analízisek segítségével = Differential diagnostic study of muscle dystrophies by molecular genetic, immunohystochemical and Western-blot analyses

A DMD/BMD betegségben célul tűzték ki a cDNS próbák alkalmazását a hordozósági státusz vizsgálatára és a deléciók pontos méretének meghatározására. Az újonnan bevezetett MLPA módszer segítségével a teljes dystrophin gén feltérképezésére, bizonyos pont mutációk kiszűrésére, a deléciók és duplikációk pontos analízisére, továbbá a hordozóság gyors szűrésére is vállalkozhattak. Összesen 120 beteg és 89 női hozzátartozó molekuláris analízisét végezték el a pályázat támogatásával. Az FSHD betegségben a komplex genetikai háttér miatt szükséges a molekuláris diagnosztikus kritériumok finomítása. A betegség hátterében álló epigenetikus változások kulcsfontosságúak lehetnek fenotípus kialakulásában. A betegség pathomechanizmusában a D4Z4 szekvenciáktól proximálisan elhelyezkedő gének megváltozott transzkripciójának van szerepe, amelynek vizsgálatára metilációs analízist alkalmaztak. A klinikai diagnózis megerősítésére összesen 90 beteg és 46 tünetmentes hozzátartozó DNS mintáját analizálták. Az LGMD betegségcsoport a betegek differenciál-diagnosztikája jelenleg csak specifikus fehérjedetektálási módszerekkel lehetségesek. Ezeket a módszereket alkalmazták azokban az esetekben, ahol az FSHD és DMD/BMD molekuláris genetikai vizsgálata negatív volt. A vizsgálati periódusban 122 beteg izombiopsziás mintája érkezett, ebből 56 esetben immunhisztokémiai, míg 20 esetben kiegészítő western blot analízis történt. További, DNS szintű analízisek 14 esetben azonosították a patogén mutációt. | The first aim of the study was to introduce cDNA probes for the analysis of DMD/BMD in order to detect carrier status and exact deletion borders. Additionally, the new MLPA technique was first introduced by us in Hungary and enabled the detection of the entire dystrophin gene with highlights on specific pointmutations, exact analysis of the deletions and duplications and moreover, on efficient screening of the carrier status. During the project, 120 affected persons and 89 female relatives were screened. In case of the FSHD molecular genetic criteria have to be improved because of the complexity of the disorder. Epigenetic influences may play a crutial role in modulating phenotype. Altered transcriptional activities of neighbouring genes proximal to the D4Z4 sequences have a key place in the pathomechanism, therefore, this effect was studied by methylation analysis. For confirmation of the clinical diagnosis 90 patients and 46 asymptomatic family members were genetically nalysed. The differential diagnosis of the heterogenous group of LGMD requires at first the specific analysis of the dystrophin-associated glycoproteins. This was used in the case of patients where the establishment of the genetic diagnosis of DMD/BMD or FSHD failed. Muscle biopsies and blood samples of 122 patients were sent to the laboratory; in total 56 immunohistochemical and 20 Western blot analyses have been performed. In 14 patients the exact pathogenic mutation has been identified by DNA sequencing

Relationship of Tree Stand Heterogeneity and Forest Naturalness

The aim of our study was to investigate if compositional (tree species richness) andstructural (vertical structure, age-structure, patterns of canopy closure) heterogeneity of the canopylayer is related to individual naturalness criteria and to overall forest naturalness at the stand scale. Thenaturalness values of the assessed criteria (tree species composition, tree stand structure, speciescomposition and structure of shrub layer and forest floor vegetation, dead wood, effects of game, sitecharacteristics) showed similar behaviour when groups of stands with different heterogeneity werecompared, regardless of the studied aspect of canopy heterogeneity. The greatest difference was foundfor criteria describing the canopy layer. Composition and structure of canopy layer, dead wood andtotal naturalness of the stand differed significantly among the stand groups showing consistentlyhigher values from homogeneous to the most heterogeneous group. Naturalness of the compositionand structure of the shrub layer is slightly but significantly higher in stands with heterogeneous canopylayer. Regarding other criteria, significant differences were found only between the homogeneous andthe most heterogeneous groups, while groups with intermediate level of heterogeneity did not differsignificantly from one extreme. However, the criterion describing effects of game got lowernaturalness values in more heterogeneous stands. Naturalness of site characteristics did not differsignificantly among the groups except for when stands were grouped based on pattern of canopyclosure. From the practical viewpoint it is shown that purposeful forestry operations affecting thecanopy layer cause changes in compositional and structural characteristics of other layers as well as inoverall stand scale forest naturalness

Perifériás és centrális receptorok részvétele opioidok fájdalomcsillapító hatásában és mellékhatás spektrumában.Korai drog expozició (perinatális és adoleszcensz) hatásának vizsgálata patkányon = On the role of central and peripheral receptors in the antinociceptive action and side effects of opioids.The influence of early (perinatal and in adolescent age) drug exposition on antinociception

A fájdalom terápiájának megoldása sürgető és releváns igény. Korábban publikáltunk néhány az agyba limitáltan penetráló morfinant. Jelen munkában kb. 30 új származékot vizsgáltunk. Perifériás vs centrális analgetikus aktivitásuk 40-400, a rosszul penetráló opioid antagonisták gátolják hatásukat, intrinsic efficacy-juk magas (perifériás hatékonyság markere az általunk kidolgozott módszer szerint ), gátló hatásuk patkány DRG sejteken perifériás támadáspont mellett szól. Morfintoleráns egérben spinálisan adva a DPDPE gátolja, míg TIPPszi potencírozza a DAMGO antinociceptív hatását. Patkányon mind naiv mind toleráns állatban a hatás potencirozó. A prodynorfin génexpresszió és dinorfin szint a dependenciáért felelős agyi régiókban módosul perifériás opioidok hatására. A perinatalisan drog expozíciónak kitett patkány anyák korai adoleszcens korú utódainak testsúlya, adaptációs képessége szignifikánsan csökkent, erőltetett úszás teszten depressziót jeleztek, fizikálisan dependensekké, vulnerábilissá váltak. Az anyai viselkedés romlott. Konklúzió: új morfinánok segítségével a C-6 szubsztitució prominens szerepét demonstráltuk a perifériás hatékonyság erősödésében, a preemptiv analgéziában, limitált légzésdepresszió és pszichológiai dependencia mellett. Az eredmény elméleti jelentősége mellett gyakorlati fontosságú a klinikum számára. Kimutattuk továbbá, hogy perinatálisan stimuláns ill. opioid kábítószerekkel kezelt patkányok utódai vulnerábilissá válnak, az abúzus veszélye nő. | There is a permanent and relevant need to manage pain. Previously we published opioids with limited access to the brain. 30 new derivatives were studied in rodents and found to be more potent analgesics, than morphine (Mo). Their peripheral vs central activites were between 40-400, the analgesic action was inhibited by poorly penetrating antagonists contrast to Mo, they block DRG cells, their intrinsic efficacy (a good marker of peripheral activity), is much higher than Mo assessed by a method elaborated by us, suggesting a peripheral site of action. DPDP administered spinally to Mo tolerant mice inhibited, while TIPPsi potentiated DAMGO analgesia.. We observed potentiation both in naive and tolerant rat. Prodynorphin gene expression and dynorphin level in brain regions responsible for the development of dependence were modified by opioids. The body weight, the adaptive behaviour of early adolescent offspring of perinatally Mo and ecstasy exposed dams decreased, they show depression in swimming test, they became physically dependent, and vulnerable to addiction. The maternal behavior of dams was disturbed. Conclusion: new data on the mechanisms of preemptive analgesia were obtained by new C-6 substituted morphinans. Respiratory depression and psychological dependence were limited. This finding beside its basic importance has practical importance too.Furthermore the offspring of dams perinatally exposed to substances of drug abuse became vulnerable and prone to be addict.

Repeated-dose toxicity of common ragweed on rats

Ambrosia artemisiifolia L. is an invasive species with highly allergenic pollens. Ragweed originates from North America, but it also occurs and is spreading in Europe, causing seasonal allergic rhinitis for millions of people. Recently, the herb of A. artemisiifolia has gained popularity as medicinal plant and food. The effects of its long-term intake are unknown; there are no toxicological data to support the safe use of this plant. The aim of our study was to assess the repeated dose toxicity of A. artemisiifolia on animals. Ragweed puree was administered in low dose (500 mg/kg b. w.) and high dose (1000 mg/kg b. w.) to male Wistar rats according to 407 OECD Guidelines for the Testing of Chemicals. Clinical symptoms, various blood chemical parameters, body weight and organ weights of the rats were measured. Reduced liver function enzymes (AST, ALT), reduced triglyceride level in the low dose and increased carbamide level in the high dose group were observed. The weight of the liver relative to body weight was significantly reduced in both groups, while the brain weight relative to body weight was significantly elevated in both groups. According to our results, the repeated use of ragweed resulted in toxic effects in rats and these results question the safety of long-term human consumption of common ragweed