Entwicklung von Verfahren zur De- und Rezellularisierung von viszeralen Organen

Während der Dezellularisierung werden Zellen und antigenes Material aus Gewebe oder Organen entfernt, sodass nur noch die weniger immunogene extrazelluläre Matrix erhalten bleibt. Da diese Matrix die Struktur des Organs erhält, eignet sie sich optimal für die Rebesiedlung mit Zellen, auch anderen Ursprungs. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Technik der De- und Rezellularisierung für abdominelle Gewebe (i.e. extrahep. Gallengang) und Organe (i.e. Leber, Pankreas) etabliert und optimiert. Hierbei wurde die Dezellularisierung von Ratten- und Schweinelebern durch die Anwendung von oszillierenden Umgebungsdruckschwankungen optimiert. Mittels ex vivo Perfusion von rebesiedelten Rattenlebern und Analyse der Konstrukte zu verschiedenen Zeitpunkten wurde die Entwicklung der Morphologie und Funktion der Konstrukte nach erfolgreicher Rebesiedlung analysiert. Außerdem wurde ein endokrines Neo Pankreas generiert durch Rebesiedlung von dezellularisierten Rattenpankreata mit Langerhans Inseln. Die Funktion dieser grafts wurde durch Glukose-stimulierte Insulin Sekretionstests nachvollzogen.During decellularization, cells and antigenic material is removed from tissue or organs and only the less immunogenic extracellular matrix is conserved. This matrix conserves the architecture of the organ and thus can be used as a biomatrix for the repopulation with cells from a different origin. We established and optimized the technique for abdominal tissue (i.e. extrahepatic bile duct) and organs (i.e. liver and pancreas). Rat and pig liver decellularization was optimized by the application of oscillating pressure changes during the process. The morphology and function of recellularized rat livers was analyzed by ex vivo perfusion and analysis of the grafts at different time points. Furthermore, we generated an endocrine Neo Pancreas by repopulating decellularized rat pancreata with islets of Langerhans. Graft function was analyzed by Glucose stimulated Insulin secretio

Das IgE-Repertoire von Kindern und Jugendlichen mit allergischem Asthma bronchiale

Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege und mit einer Prävalenz von ca. 10% in Deutschland die häufigste chronische Erkrankung im Kindesalter. Die Erkenntnislage bezüglich der Ursachen allergischer Erkrankungen und insbesondere ihrer Zunahme in westlichen Gesellschaften ist noch unbefriedigend. Obwohl die Pathogenese des allergischen Asthma multifaktoriell und komplex ist, darf das Immunglobulin E (IgE) als das zentrale Effektormolekül der allergischen Immunantwort vom Soforttyp angesehen werden. Gebunden auf der Oberfläche von Mastzellen, generieren die IgE-Antikörper eine entscheidende Schnittstelle zwischen Allergenen und dem Immunsystem. Auf welche Weise die IgE-Antwort und damit das IgE-Repertoire im Rahmen allergischer Erkrankungen geformt werden, ist noch unklar. Gegenstand der aktuellen wissenschaftlichen Diskussion zur Immunaktivierung bei der IgE-Antwort sind alternative Aspekte: Der von der gegenwärtigen Datenlage favorisierte Mechanismus ist eine Superantigen-ähnliche Interaktion der Allergene mit dem Antikörper. Darüber hinaus wird die Beteiligung von B1-Zellen mit niedrigaffiner polyklonaler Antikörperreifung diskutiert. Die Hypothese der vorliegenden Dissertation ist, dass die IgE-Antwort beim allergischen Asthma eine klassische Antigen-gesteuerte und oligoklonale Immunantwort vom B2-Typ darstellt. Es existieren publizierte Daten zu allen drei potentiellen Reifungsmechanismen der allergischen Immunantwort; gemeinsam ist den korrespondierenden Studien jedoch eine relativ kleine Zahl von erhobenen IgE-Sequenzen (meist unter 100), welche oftmals von lediglich einem einzigen Patienten stammen. Daten zum IgE-Repertoire während Kindheit und Adoleszenz fehlen bis dato gänzlich, obwohl dies die Lebensphase mit der größten Dynamik allergischer Krankheiten ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher eine statistisch ausreichende Anzahl funktioneller IgE-Sequenzen von Kindern mit allergischem Asthma zu gewinnen, um somit eine solide Datengrundlage zur Analyse der immunogenetischen Charakteristik zu schaffen. Hierzu wurde eine hochsensitive reverse Transkriptase-PCR entwickelt, welche es erlaubt, humane IgE-Transkripte auch aus relativ kleinen Blutvolumina (500 µl) zu amplifizieren. Mittels dieser IgE-PCR wurde das IgE-Repertoire aus dem peripheren Blut von 13 Kindern im Alter von 3 - 16 Jahren mit allergischem Asthma amplifiziert. Die Amplifikate wurden isoliert, kloniert und sequenziert. Dabei wurden insgesamt 1.366 funktionelle IgE-Sequenzen gewonnen. Dies stellt die bis dato größte Datenbank humaner IgE-Transkripte dar. Als Referenz wurden 308 IgM-Sequenzen derselben Kinder gewonnen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten einige der publizierten Vorarbeiten zum Thema nicht bestätigen. So fand sich bei der Analyse der VH-Familiennutzung kein Hinweis auf eine Superantigen-ähnliche Aktivierung. Das Muster der im IgE Repertoire genutzten VH-Familien entsprach der Keimbahnverteilung dieser Gene, was sowohl bei IgE (56%), als auch bei IgM (55%) VH3 zur am häufigsten verwendeten Familie machte. Verglichen mit IgM (43 ± 9,8 bp) zeigten die IgE-Sequenzen (48 ± 13 bp) eine um 5 bp längere CDR-H3 (p < 0,001). Die somatische Mutationsrate der IgE-Transkripte (72‰) war mehr als dreimal so hoch wie die der IgM-Transkripte (20‰) (p < 0,001); dabei wurde keine einzige unmutierte IgE-Sequenz gefunden. Somit erscheint eine relevante Beteiligung von B1-Zellen bei der Entstehung dieser Antikörper unwahrscheinlich. Während bei nur 9% der IgM-Sequenzen eine signifikante Anhäufung von replacement-Mutationen in der klassischen Antigenbindungsstelle gefunden wurde, zeigten 29% der IgE-Transkripte Zeichen einer signifikanten Antigenselektion (p < 0,001). Darüber hinaus waren die IgE-Transkripte klonal enger verwandt als die IgM-Transkripte: Die 281 unique IgM-Sequenzen gehörten zu 227 verschiedenen Zellklonen, während 473 unique IgE-Sequenzen nur 142 Klonen zugeordnet werden konnten. Auch dieser Befund spricht für eine zielgerichtete und oligoklonal geprägte Antwort des adaptiven Immunsystems. Zusammenfassend spiegelt das IgE-Repertoire im Blut von Kindern mit allergischem Asthma eine klassische, oligoklonale Immunantwort vom B2-Typ wider. Perspektivisch liefert die vorliegende Arbeit die erforderlichen Methoden und die Referenzdaten für eine Charakterisierung der Immunmechanismen bei therapeutischen Ansätzen mit dem Ziel, die IgE-Antwort zu modifizieren, wie z. B. der anti-IgE-Therapie mit monoklonalen Antikörpern oder der allergenspezifischen Immuntherapie

Surface modification of decellularized bovine carotid arteries with human vascular cells significantly reduces their thrombogenicity

Background: Since autologous veins are unavailable when needed in more than 20% of cases in vascular surgery, the production of personalized biological vascular grafts for implantation has become crucial. Surface modification of decellularized xenogeneic grafts with vascular cells to achieve physiological luminal coverage and eventually thromboresistance is an important prerequisite for implantation. However, ex vivo thrombogenicity testing remains a neglected area in the field of tissue engineering of vascular grafts due to a multifold of reasons. Methods: After seeding decellularized bovine carotid arteries with human endothelial progenitor cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, luminal endothelial cell coverage (LECC) was correlated with glucose and lactate levels on the cell supernatant. Then a closed loop whole blood perfusion system was designed. Recellularized grafts with a LECC > 50% and decellularized vascular grafts were perfused with human whole blood for 2 h. Hemolysis and complete blood count evaluation was performed on an hourly basis, followed by histological and immunohistochemical analysis. Results: While whole blood perfusion of decellularized grafts significantly reduced platelet counts, platelet depletion from blood resulting from binding to re-endothelialized grafts was insignificant (p = 0.7284). Moreover, macroscopic evaluation revealed thrombus formation only in the lumen of unseeded grafts and histological characterization revealed lack of CD41 positive platelets in recellularized grafts, thus confirming their thromboresistance. Conclusion: In the present study we were able to demonstrate the effect of surface modification of vascular grafts in their thromboresistance in an ex vivo whole blood perfusion system. To our knowledge, this is the first study to expose engineered vascular grafts to human whole blood, recirculating at high flow rates, immediately after seeding

Das IgE-Repertoire von Kindern und Jugendlichen mit allergischem Asthma bronchiale

Das allergische Asthma bronchiale ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Atemwege und mit einer Prävalenz von ca. 10% in Deutschland die häufigste chronische Erkrankung im Kindesalter. Die Erkenntnislage bezüglich der Ursachen allergischer Erkrankungen und insbesondere ihrer Zunahme in westlichen Gesellschaften ist noch unbefriedigend. Obwohl die Pathogenese des allergischen Asthma multifaktoriell und komplex ist, darf das Immunglobulin E (IgE) als das zentrale Effektormolekül der allergischen Immunantwort vom Soforttyp angesehen werden. Gebunden auf der Oberfläche von Mastzellen, generieren die IgE-Antikörper eine entscheidende Schnittstelle zwischen Allergenen und dem Immunsystem. Auf welche Weise die IgE-Antwort und damit das IgE-Repertoire im Rahmen allergischer Erkrankungen geformt werden, ist noch unklar. Gegenstand der aktuellen wissenschaftlichen Diskussion zur Immunaktivierung bei der IgE-Antwort sind alternative Aspekte: Der von der gegenwärtigen Datenlage favorisierte Mechanismus ist eine Superantigen-ähnliche Interaktion der Allergene mit dem Antikörper. Darüber hinaus wird die Beteiligung von B1-Zellen mit niedrigaffiner polyklonaler Antikörperreifung diskutiert. Die Hypothese der vorliegenden Dissertation ist, dass die IgE-Antwort beim allergischen Asthma eine klassische Antigen-gesteuerte und oligoklonale Immunantwort vom B2-Typ darstellt. Es existieren publizierte Daten zu allen drei potentiellen Reifungsmechanismen der allergischen Immunantwort; gemeinsam ist den korrespondierenden Studien jedoch eine relativ kleine Zahl von erhobenen IgE-Sequenzen (meist unter 100), welche oftmals von lediglich einem einzigen Patienten stammen. Daten zum IgE-Repertoire während Kindheit und Adoleszenz fehlen bis dato gänzlich, obwohl dies die Lebensphase mit der größten Dynamik allergischer Krankheiten ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher eine statistisch ausreichende Anzahl funktioneller IgE-Sequenzen von Kindern mit allergischem Asthma zu gewinnen, um somit eine solide Datengrundlage zur Analyse der immunogenetischen Charakteristik zu schaffen. Hierzu wurde eine hochsensitive reverse Transkriptase-PCR entwickelt, welche es erlaubt, humane IgE-Transkripte auch aus relativ kleinen Blutvolumina (500 µl) zu amplifizieren. Mittels dieser IgE-PCR wurde das IgE-Repertoire aus dem peripheren Blut von 13 Kindern im Alter von 3 - 16 Jahren mit allergischem Asthma amplifiziert. Die Amplifikate wurden isoliert, kloniert und sequenziert. Dabei wurden insgesamt 1.366 funktionelle IgE-Sequenzen gewonnen. Dies stellt die bis dato größte Datenbank humaner IgE-Transkripte dar. Als Referenz wurden 308 IgM-Sequenzen derselben Kinder gewonnen. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit konnten einige der publizierten Vorarbeiten zum Thema nicht bestätigen. So fand sich bei der Analyse der VH-Familiennutzung kein Hinweis auf eine Superantigen-ähnliche Aktivierung. Das Muster der im IgE Repertoire genutzten VH-Familien entsprach der Keimbahnverteilung dieser Gene, was sowohl bei IgE (56%), als auch bei IgM (55%) VH3 zur am häufigsten verwendeten Familie machte. Verglichen mit IgM (43 ± 9,8 bp) zeigten die IgE-Sequenzen (48 ± 13 bp) eine um 5 bp längere CDR-H3 (p < 0,001). Die somatische Mutationsrate der IgE-Transkripte (72‰) war mehr als dreimal so hoch wie die der IgM-Transkripte (20‰) (p < 0,001); dabei wurde keine einzige unmutierte IgE-Sequenz gefunden. Somit erscheint eine relevante Beteiligung von B1-Zellen bei der Entstehung dieser Antikörper unwahrscheinlich. Während bei nur 9% der IgM-Sequenzen eine signifikante Anhäufung von replacement-Mutationen in der klassischen Antigenbindungsstelle gefunden wurde, zeigten 29% der IgE-Transkripte Zeichen einer signifikanten Antigenselektion (p < 0,001). Darüber hinaus waren die IgE-Transkripte klonal enger verwandt als die IgM-Transkripte: Die 281 unique IgM-Sequenzen gehörten zu 227 verschiedenen Zellklonen, während 473 unique IgE-Sequenzen nur 142 Klonen zugeordnet werden konnten. Auch dieser Befund spricht für eine zielgerichtete und oligoklonal geprägte Antwort des adaptiven Immunsystems. Zusammenfassend spiegelt das IgE-Repertoire im Blut von Kindern mit allergischem Asthma eine klassische, oligoklonale Immunantwort vom B2-Typ wider. Perspektivisch liefert die vorliegende Arbeit die erforderlichen Methoden und die Referenzdaten für eine Charakterisierung der Immunmechanismen bei therapeutischen Ansätzen mit dem Ziel, die IgE-Antwort zu modifizieren, wie z. B. der anti-IgE-Therapie mit monoklonalen Antikörpern oder der allergenspezifischen Immuntherapie

Struggle in the bubble - a prospective study on the effect of remote learning and distance education on confidence in practical surgical skills acquired during COVID-19

Abstract Background The coronavirus disease (COVID-19) has significantly changed healthcare systems and medical education. Universities were required to develop innovative curricula based on remote and distance education to continue medical education. This prospective questionnaire-based study aimed to investigate the impact of COVID-19-associated remote learning on the surgical training of medical students. Methods A 16-item questionnaire-based survey was distributed to medical students at the University Hospital of Münster before and after a surgical skills laboratory (SSL). Two cohorts were included: summer semester 2021 (COV-19), with rigorous social-distancing restrictions requiered SSL to be remotely, and winter semester 2021 (postCOV-19), in which the SSL was provided as a face-to-face, hands-on course. Results Both, cohorts showed a significant improvement in self-assessment of pre- and post-course confidence. While no significant difference in the average gain in self-confidence for sterile working was observed between the two cohorts, improvement in self-confidence was significantly higher in the COV-19 cohort regarding skin suturing and knot tying (p < 0.0001). However the average improvement regarding history and physical was significantly higher in the postCOV-19 cohort (p < 0.0001). In subgroup analysis, gender-associated differences varied in the two cohorts and were not related to specific subtasks, while age-stratified analysis revealed superior results for younger students. Conclusion The results of our study underline the usability, feasibility, and adequacy of remote learning for the surgical training of medical students. The on-site distance education version, presented in the study, allows the continuing of hands-on experience in a safe environment in compliance with governmental social-distancing restrictions

Resection margin status at the portomesenteric axis may not determine oncologic outcome after pancreaticoduodenectomy for lymph node-positive pancreatic ductal adenocarcinoma.

BACKGROUND Lymph node and resection margin status are associated with oncologic outcomes after pancreaticoduodenectomy for pancreatic ductal adenocarcinoma. However, surgical radicality at the portomesenteric axis in case of suspected infiltration remains controversial. METHODS Clinicopathological data of patients who underwent a partial or total pancreaticoduodenectomy for PDAC between 2012 to 2019 in 2 major hepato-pancreato-biliary centers in Germany and Switzerland were assessed. We evaluated the impact of positive resection margins at the vascular, parenchymal, and retropancreatic surfaces on overall survival in patients with and without lymph node involvement. Margin-positive vascular resection included both patients with positive margins at the vascular groove and the resected venous wall. RESULTS During the study period, 217 patients underwent partial/total pancreaticoduodenectomy for pancreatic ductal adenocarcinoma. After excluding 7 patients suffering postoperative complications resulting in mortality within 90 days after surgery (3%), 169 patients had lymph node involvement (80%). In the entire study cohort, margin-positive resection (33%) was significantly associated with worse overall survival (3-year overall survival: margin-positive resection: 27% vs margin-negative resection: 43%, P = .014). Among patients with positive lymph nodes, margin-positive vascular resection (n = 48, 28%) was not significantly associated with impaired overall survival (3-year overall survival: margin-positive vascular resection: 28% vs margin-negative vascular resection: 36%, P = .065). On the contrary, margin-positive parenchymal resection (n = 7, 4%) (3-year overall survival: margin-positive parenchymal resection: 0% vs margin-negative parenchymal resection: 35%, P < .0001) and margin-positive retropancreatic resection (n = 21, 12%) (3-year overall survival: margin-positive retropancreatic resection: 6% vs margin-negative retropancreatic resection: 39%, P < .0001) significantly diminished overall survival in univariate and multivariate analysis in all patients. Among patients without lymph node involvement (n = 41, 20%), there were no margin-positive parenchymal or margin-positive retropancreatic resections. In contrast, only 5 patients had margin-positive vascular resection (12%), with overall survival compared to those with margin-negative vascular resection. CONCLUSIONS In patients with pancreatic ductal adenocarcinoma and lymph nodal positivity, resection status at the parenchymal and retropancreatic surface but probably not at the portal and/or superior mesenteric vein is a determinant of survival. Therefore, margin-negative resection should be pursued during pancreaticoduodenectomy. However, radical venous resection and/or reconstruction for suspected tumor infiltration may not be necessary for patients with intraoperatively detected lymph node metastases

The Impact of Phase-Specific Macrophage Depletion on Intestinal Anastomotic Healing

Intestinal anastomotic healing (AH) is critical in colorectal surgery, since disruptive AH leads to anastomotic leakage, a feared postoperative complication. Macrophages are innate immune cells and are instrumental in orchestrating intestinal wound healing, displaying a functional dichotomy as effectors of both tissue injury and repair. The aim of this study was to investigate the phase-specific function and plasticity of macrophages during intestinal AH. Transgenic CD11b diphtheria toxin receptor (CD11b-DTR) mice were used to deplete intestinal macrophages in a temporally controlled manner. Distal colonic end-to-end anastomoses were created in CD11b-DTR, and wild-type mice and macrophages were selectively depleted during either the inflammatory (day 0–3), proliferative (day 4–10), or reparative (day 11–20) phase of intestinal AH, respectively. For each time point, histological and functional analysis as well as gene set enrichment analysis (GSEA) of RNA-sequencing data were performed. Macrophage depletion during the inflammatory phase significantly reduced the associated inflammatory state without compromising microscopic AH. When intestinal macrophages were depleted during the proliferative phase, AH was improved, despite significantly reduced perianastomotic neoangiogenesis. Lastly, macrophages were depleted during the reparative phase and GSEA revealed macrophage-dependent pathways involved in collagen remodeling, cell proliferation, and extracellular matrix composition. However, AH remained comparable at this late timepoint. These results demonstrate that during intestinal AH, macrophages elicit phase-specific effects, and that therapeutic interventions must critically balance their dual and timely defined role

Urinary Biomarkers α-GST and π-GST for Evaluation and Monitoring in Living and Deceased Donor Kidney Grafts

The aim of this study was to analyze the value of urine α- and π-GST in monitoring and predicting kidney graft function following transplantation. In addition, urine samples from corresponding organ donors was analyzed and compared with graft function after organ donation from brain-dead and living donors. Urine samples from brain-dead (n = 30) and living related (n = 50) donors and their corresponding recipients were analyzed before and after kidney transplantation. Urine α- and π-GST values were measured. Kidney recipients were grouped into patients with acute graft rejection (AGR), calcineurin inhibitor toxicity (CNI), and delayed graft function (DGF), and compared to those with unimpaired graft function. Urinary π-GST revealed significant differences in deceased kidney donor recipients with episodes of AGR or DGF at day one after transplantation (p = 0.0023 and p = 0.036, respectively). High π-GST values at postoperative day 1 (cutoff: >21.4 ng/mg urine creatinine (uCrea) or >18.3 ng/mg uCrea for AGR or DGF, respectively) distinguished between rejection and no rejection (sensitivity, 100%; specificity, 66.6%) as well as between DGF and normal-functioning grafts (sensitivity, 100%; specificity, 62.6%). In living donor recipients, urine levels of α- and π-GST were about 10 times lower than in deceased donor recipients. In deceased donors with impaired graft function in corresponding recipients, urinary α- and π-GST were elevated. α-GST values >33.97 ng/mg uCrea were indicative of AGR with a sensitivity and specificity of 77.7% and 100%, respectively. In deceased donor kidney transplantation, evaluation of urinary α- and π-GST seems to predict different events that deteriorate graft function. To elucidate the potential advantages of such biomarkers, further analysis is warranted