Vibrio cholerae interactions with Mytilus galloprovincialis hemocytes mediated by serum components

Edible bivalves (e.g., mussels, oysters) can accumulate large amount of bacteria in their tissues and act as passive carriers of pathogens to humans. Bacterial persistence inside bivalves depends, at least in part, on hemolymph anti-bacterial activity that is exerted by both serum soluble factors and phagocytic cells (i.e., the hemocytes). It was previously shown that Mytilus galloprovincialis hemolymph serum contains opsonins that mediate D-mannose-sensitive interactions between hemocytes and Vibrio cholerae O1 El Tor bacteria that carry the mannose-sensitive hemagglutinin (MSHA). These opsonins enhance phagocytosis and killing of vibrios by facilitating their binding to hemocytes. Since V. cholerae strains not carrying the MSHA ligand (O1 classical, non-O1/O139) are present in coastal water and can be entrapped by mussels, we studied whether in mussel serum, in addition to opsonins directed toward MSHA, other components can mediate opsonization of these bacteria. By comparing interactions of O1 classical and non-O1/O139 strains with hemocytes in artificial sea water and serum, it was found that M. galloprovincialis serum contains components that increase by at approximately twofold their adhesion to, association with, and killing by hemocytes. Experiments conducted with high and low molecular mass fractions obtained by serum ultrafiltration indicated that these compounds have molecular mass higher than 5000 Da. Serum exposure to high temperature (80°C) abolished its opsonizing capability suggesting that the involved serum active components are of protein nature. Further studies are needed to define the chemical properties and specificity of both the involved bacterial ligands and hemolymph opsonins. This information will be central not only to better understand V. cholerae ecology, but also to improve current bivalve depuration practices and properly protect human health

gbpA as a Novel qPCR Target for the Species-Specific Detection of Vibrio cholerae O1, O139, Non-O1/Non-O139 in Environmental, Stool, and Historical Continuous Plankton Recorder Samples

The Vibrio cholerae N-acetyl glucosamine-binding protein A (GbpA) is a chitin-binding protein involved in V . cholerae attachment to environmental chitin surfaces and human intestinal cells. We previously investigated the distribution and genetic variations of gbpA in a large collection of V . cholerae strains and found that the gene is consistently present and highly conserved in this species. Primers and probe were designed from the gbpA sequence of V . cholerae and a new Taq-based qPCR protocol was developed for diagnostic detection and quantification of the bacterium in environmental and stool samples. In addition, the positions of primers targeting the gbpA gene region were selected to obtain a short amplified fragment of 206 bp and the protocol was optimized for the analysis of formalin-fixed samples, such as historical Continuous Plankton Recorder (CPR) samples. Overall, the method is sensitive (50 gene copies), highly specific for V . cholerae and failed to amplify strains of the closely-related species Vibrio mimicus . The sensitivity of the assay applied to environmental and stool samples spiked with V . cholerae ATCC 39315 was comparable to that of pure cultures and was of 10 2 genomic units/l for drinking and seawater samples, 10 1 genomic units/g for sediment and 10 2 genomic units/g for bivalve and stool samples. The method also performs well when tested on artificially formalin-fixed and degraded genomic samples and was able to amplify V . cholerae DNA in historical CPR samples, the earliest of which date back to August 1966. The detection of V . cholerae in CPR samples collected in cholera endemic areas such as the Benguela Current Large Marine Ecosystem (BCLME) is of particular significance and represents a proof of concept for the possible use of the CPR technology and the developed qPCR assay in cholera studies

In Vitro Assessment of Shiitake Mushroom (Lentinula edodes) Extract for Its Antigingivitis Activity

Gingivitis is a preventable disease characterised by inflammation of the gums due to the buildup of a microbial biofilm at the gingival margin. It is implicated as a precursor to periodontitis, a much more serious problem which includes associated bone loss. Unfortunately, due to poor oral hygiene among the general population, gingivitis is prevalent and results in high treatment costs. Consequently, the option of treating gingivitis using functional foods, which promote oral health, is an attractive one. Medicinal mushrooms, including shiitake, have long been known for their immune system boosting as well as antimicrobial effects; however, they have not been employed in the treatment of oral disease. In the current study, the effectiveness of shiitake mushroom extract was compared to that of the active component in the leading gingivitis mouthwash, containing chlorhexidine, in an artificial mouth model (constant depth film fermenter). The total bacterial numbers as well as numbers of eight key taxa in the oral community were investigated over time using multiplex qPCR. The results indicated that shiitake mushroom extract lowered the numbers of some pathogenic taxa without affecting the taxa associated with health, unlike chlorhexidine which has a limited effect on all taxa

Effects of Fruit and Vegetable Low Molecular Mass Fractions on Gene Expression in Gingival Cells Challenged with Prevotella intermedia and Actinomyces naeslundii

Low molecular mass (LMM) fractions obtained from extracts of raspberry, red chicory, and Shiitake mushrooms have been shown to be an useful source of specific antibacterial, antiadhesion/coaggregation, and antibiofilm agent(s) that might be used for protection towards caries and gingivitis. In this paper, the effects of such LMM fractions on human gingival KB cells exposed to the periodontal pathogens Prevotella intermedia and Actinomyces naeslundii were evaluated. Expression of cytokeratin 18 (CK18) and β4 integrin (β4INT) genes, that are involved in cell proliferation/differentiation and adhesion, and of the antimicrobial peptide β2 defensin (HβD2) in KB cells was increased upon exposure to either live or heat-killed bacteria. All LMM fractions tested prevented or reduced the induction of gene expression by P. intermedia and A. naeslundii depending on the experimental conditions. Overall, the results suggested that LMM fractions could modulate the effects of bacteria associated with periodontal disease in gingival cells

The Effects of Fractions from Shiitake Mushroom on Composition and Cariogenicity of Dental Plaque Microcosms in an In Vitro Caries Model

The aim of the current study was to investigate the anticariogenic potential of the (sub)fractions obtained from the edible mushroom shiitake (Lentinula edodes) in in vitro caries model. We used a modified constant depth film fermentor (CDFF) with pooled saliva as the inoculum and bovine dentin as a substratum. The test compounds were low molecular weight fraction (MLMW) of the shiitake extract and subfractions 4 and 5 (SF4 and SF5) of this fraction. Chlorhexidine (CHX) and water served as a positive and a negative control, respectively. Dentin mineral loss was quantified (TMR), microbial shifts within the microcosms were determined (qPCR), and the acidogenicity of the microcosms was assessed (CIA). From the compounds tested, the SF4 of shiitake showed strong inhibiting effect on dentin demineralization and induced microbial shifts that could be associated with oral health. The acid producing potential was increased, suggesting uncoupling of the glycolysis of the microbiota by the exposure to SF4. In conclusion, the results suggest that SF4 of shiitake has an anticariogenic potential

Effects of Fruit and Vegetable Low Molecular Mass Fractions on Gene Expression in Gingival Cells Challenged with Prevotella intermedia and Actinomyces naeslundii

Low molecular mass (LMM) fractions obtained from extracts of raspberry, red chicory, and Shiitake mushrooms have been shown to be an useful source of specific antibacterial, antiadhesion/coaggregation, and antibiofilm agent(s) that might be used for protection towards caries and gingivitis. In this paper, the effects of such LMM fractions on human gingival KB cells exposed to the periodontal pathogens Prevotella intermedia and Actinomyces naeslundii were evaluated. Expression of cytokeratin 18 (CK18) and β4 integrin (β4INT) genes, that are involved in cell proliferation/differentiation and adhesion, and of the antimicrobial peptide β2 defensin (HβD2) in KB cells was increased upon exposure to either live or heat-killed bacteria. All LMM fractions tested prevented or reduced the induction of gene expression by P. intermedia and A. naeslundii depending on the experimental conditions. Overall, the results suggested that LMM fractions could modulate the effects of bacteria associated with periodontal disease in gingival cells

Vibrio Cholerae adhesins: ecological role and new perspective for vaccine development

Il colera è una patologia a trasmissione oro-fecale causata da Vibrio cholerae, un microorganismo indigeno delle acque costiere dove può trovarsi sia in forma planctonica che in associazione a piante e animali acquatici. La sopravvivenza e la diffusione di V. cholerae nelle acque e l’acquisizione di determinanti di virulenza sono fortemente influenzate da fattori quali temperatura, salinità, pH e, in particolare, dalla presenza di organismi dello zooplancton. Infatti, V. cholerae è in grado di aderire tenacemente all’esoscheletro chitinoso dei crostacei zooplanctonici e, soprattutto, dei copepodi che ne costituiscono il principale serbatoio ambientale. Lo studio dei fattori che influenzano l’ecologia di V. cholerae nelle acque e dei meccanismi molecolari alla base delle sue interazioni con i substrati presenti nel mare è, di conseguenza, di grande importanza per la comprensione della trasmissione all’uomo di questo patogeno. La prima fase di questo studio ha avuto come obiettivi principali:  la valutazione dell’influenza di fattori ambientali quali temperatura, pH e salinità sulle interazioni di V. cholerae con superfici biotiche e abiotiche dell’ambiente acquatico,  la valutazione del ruolo svolto da due importanti adesine batteriche leganti la chitina, GbpA (N-acetylglucosamine binding protein A, anche coinvolta nel legame alle cellule intestinali umane) e MSHA (Mannose-sensitive haemoagglutinin), nelle interazioni di V. cholerae con substrati inorganici ed organismi zooplanctonici. Le stesse adesine sono state studiate anche per il ruolo svolto nelle interazioni con i molluschi bivalvi che, nei paesi occidentali, rappresentano uno dei principali vettori di trasmissione dei vibrioni all’uomo. Saggi condotti in vitro hanno dimostrato che il più importante fattore ambientale in grado di influenzare l’associazione di V. cholerae con particelle di chitina è la temperatura che, ad esempio, variando da 5°C a 25°C, determina un incremento del numero di batteri adesi di 2.5 volte e, variando da 15°C a 25°C, induce un aumento dell’espressione dei geni gbpA e mshA di 2.7 volte. L’effetto della temperatura è stato confermato da studi in situ condotti nell’arco di un anno, mediante campionamenti mensili, nelle acque costiere del Mar Ligure. I risultati ottenuti hanno mostrato un aumento consistente della percentuale di vibrioni adesi allo zooplankton in corrispondenza di temperature superiori a 22°C. Questi risultati, oltre a confermare l’influenza della temperatura sulla colonizzazione dello zooplancton e, quindi, sulla persistenza dei vibrioni nelle acque, forniscono la prima evidenza sperimentale che tali effetti siano correlati all’espressione delle adesine GbpA e MSHA. Allo scopo di analizzare il ruolo svolto da GbpA e MSHA nelle interazioni di V. cholerae con organismi acquatici, le caratteristiche adesive dei due mutanti GbpA e MSHA difettivi, costruiti mediante mutagenesi per scambio allelico, sono state confrontate con quelle del ceppo parentale. I saggi di adesione sono stati condotti mediante marcatura dei batteri con isotopo radioattivo e quantificazione della radioattività associata al substrato, e/o marcatura con “green fluorescent protein” per l’osservazione al microscopio confocale a scansione. I risultati hanno dimostrato per entrambi i mutanti una riduzione, rispetto al ceppo parentale, dell’efficienza di adesione a tutti i substrati in esame, indicando per le due adesine un ruolo analogo nell’interazione di V. cholerae con lo zooplancton e i tessuti di mitilo. E’ interessante rilevare che solo il mutante difettivo per MSHA ha mostrato, rispetto al ceppo parentale, una riduzione nell’attacco a substrati inorganici (granuli di quarzite e superfici di polivinilcloruro). Questi risultati suggeriscono perciò che MSHA presenti proprietà adesive indipendenti dalla chimica della superficie di contatto. Al contrario, l’adesina GbpA, specificamente diretta verso l’N-acetilglucosamina, media l’adesione batterica a superfici contenenti tale zucchero tra cui, nel mare, la chitina (polimero di N-acetilglucosamina) e le membrane di cellule di mitilo e, nell’uomo, le cellule epiteliali intestinali. Per queste caratteristiche adesive che si manifestano sia nell’ambiente acquatico che nell’uomo, GbpA è stata definita “dual role colonization factor”. La seconda fase di questo studio è stata incentrata sull’adesina GbpA, con i seguenti obiettivi:  valutarne la diffusione in ceppi clinici e ambientali di V. cholerae e di altre specie di Vibrio,  compararne la sequenza genica in ceppi di V. cholerae,  clonarne il gene in Escherichia coli per costruire una proteina ricombinante marcata con tag di poly-His (rGbpA-His) di cui valutare le capacità adesive. I risultati ottenuti mediante PCR hanno dimostrato che il gene gbpA è presente in tutti i ceppi testati di V. cholerae (n = 488), di diversa origine, sierogruppo e biotipo, e nel 96% dei ceppi (n = 114) di altre specie di Vibrio. Dall’analisi filogenetica e dall’allineamento multiplo di 38 sequenze aminoacidiche di GbpA si è potuto constatare che il gene in esame è altamente conservato all’interno della specie V. cholerae. La diffusione del gene fra i vibrioni, la sequenza conservata e il doppio ruolo che l’adesina svolge nell’ambiente e nell’uomo, ne suggeriscono l’impiego per la preparazione di un nuovo vaccino contro il colera. L’uso della proteina GbpA per interventi di tipo profilattico potrebbe, infatti, presentare il vantaggio di combattere l’infezione nell’uomo e di agire sull’ecologia del patogeno nel suo ambiente naturale. La proteina rGbpA-His è stata quindi espressa in E. coli e purificata mediante cromatografia di affinità. Poiché le capacità adesive della proteina ricombinante così ottenuta sono risultate simili a quelle della proteina nativa di V. cholerae, rGbpA-His verrà utilizzata in studi successivi di valutazione dell’immunogenicità. Nel complesso, questa tesi evidenzia l’importanza dello studio dell’ecologia dei vibrioni patogeni nell’ambiente acquatico non solo per una migliore comprensione della loro trasmissione all’uomo ma anche per lo sviluppo di nuove strategie antimicrobiche

Functional foods and strategies contrasting bacterial adhesion

none5Antibacterial strategies targeting bacterial adhesion to substrates are considered a valuable alternative to traditional antibiotic therapy, in view of the great advantage they bring in combating the infectious process at the very early stage without selecting for drug resistant cells. Amongst bioactive compounds with activity against bacterial adhesion, several are found in natural food and beverages, such as cranberry, tea, coffee, wine and milk. For the analysis of their anti- infective potential, successful experimental models can be conducted using different substrates from the oral cavity. Studies conducted so far in this field allowed the discovery of a variety of anti-adhesive fractions and compounds proven to be effective against bacterial traits involved in the development of oral pathologies such as caries and gingivitis/periodontitis. Discovering new anti-adhesive compounds from natural products, unravelling and testing their prophylactic and therapeutic values, and improving their use in the general population are promising new frontiers in the global fight against human infectious diseases.C. SIGNORETTO; P. CANEPARI; M. STAUDER; L. VEZZULLI; C. PRUZZOC., Signoretto; P., Canepari; Stauder, MONICA NELLY; Vezzulli, Luigi; Pruzzo, Carl

Sostanze presenti negli alimenti ad attività inibente l’adesione dei batteri cariogeni

La carie dentale è una delle più comuni malattie infettive dell’uomo alla cui genesi concorrono almeno tre elementi, l’ospite, la dieta e specifici batteri cariogeni, indigeni del cavo orale. Questi microorganismi manifestano il proprio potenziale patogeno quando il delicato equilibrio esistente tra difese dell’ospite e potere aggressivo microbico si rompe. La carie dentale richiede l’iniziale accumulo di placca, biofilm microbico che permette ai microrganismi inclusi di persistere sulla superficie di denti e gengive. L’agente eziologico principale è lo Streptococcus mutans che, in presenza di saccarosio, produce mutano, polimero che partecipa alla formazione della placca e favorisce la tenace adesione dei batteri alla superficie dentale, e acido lattico, responsabile della demineralizzazione dell’idrossiapatite del dente. La riduzione della placca e/o il controllo della sua proliferazione svolgono, pertanto, un ruolo cruciale nella riduzione dell’incidenza della carie e, di conseguenza, numerose sostanze capaci di disaggregare S. mutans dalla placca o di interferire con la sua adesione sono attualmente allo studio. Da numerosi lavori apparsi in letteratura e da studi da noi condotti è chiaramente emerso che anche i componenti di comuni alimenti e/o bevande possono proteggere nei confronti della carie ed essere di aiuto nel mantenimento della salute orale. Ad esempio, componenti polifenolici del tè e del mirtillo possiedono attività antiplacca poiché inibiscono la produzione di biofilm e acidi. Nell’ambito delle ricerche condotte sui componenti alimentari con attività anti-carie, un importante contributo è costituito dagli studi da noi condotti su caffè, caffè d’orzo e vino, tipiche bevande italiane di amplissima diffusione. Infatti, sono state evidenziate per queste bevande e alcuni loro componenti ottenuti mediante SPE (solid phase extraction) e/o GFC (gel filtration chromatography) proprietà antiadesive e antibiofilm dirette nei confronti di S. mutans e altri streptococchi del cavo orale. Verranno presentati i risultati più interessanti ottenuti nel corso delle nostre indagini con alcuni dei componenti esaminati, quali melanoidine del caffè e caffè d’orzo, e proantocianidine del vino. In particolare, verranno analizzati i risultati ottenuti con ceppi ATCC e clinici cimentati con i vari componenti alimentari in esperimenti di adesione a e distacco da particelle di idrossiapatite, coaggregazione, adesione a cellule in coltura, e formazione di biofilm. Sebbene debba essere usata cautela nell’interpretazione del significato in vivo degli studi condotti in vitro, i nostri risultati suggeriscono che alcuni dei componenti analizzati potrebbero essere utilizzati per la produzione di cibi fortificati, prebiotici, dentifrici e collutori utili nella profilassi e/o terapia della carie dentale

Melanoidin antioxidant and anticaries properties

Maillard reaction takes place at high rate in thermal treated foods, such as bakery products, coffee, barley coffee, beer, giving rise to a large number of compounds with different chemical features, molecular weight (MW) and health-promoting or toxicological properties. Among Maillard reaction products (MRPs), melanoidins, generally defined as brown and acidic macromolecular compounds containing nitrogen, attracted researchers’ interest for their heterogeneous and complex chemical structure, still poorly defined, and their biological properties, such as antioxidant, antiallergenic, antiadhesive, antimicrobial, antimutagenic and citotoxic capacities. In our previous investigations high molecular weight nitrogen containing components with different chemical features, were isolated from coffee and barley coffee and studied for their antioxidant and anticaries properties. As regards antioxidant capacity, five HMW coffee components and a very HMW barley coffee melanoidin showed high activity in an ex vivo system consisting of rat hepatocyte microsomes. Such activity could be attributed to radical scavenger properties, metal chelating activity and reducing power showed in different extent by the isolated components when tested in different chemical systems. Considering coffee and barley coffee melanoidin anticaries properties, they are supported by the capacity, showed also in this case in different extent by each isolated component, to prevent adhesion to hydroxyapatite (HA), to induce detachment from HA, or to prevent biofilm formation by Streptococcus mutans considered the main aetiological agent of caries