Impact de l’épicatéchine sur l’hémostase et la structure du caillot de fibrine

Flavonoids are the most widespread polyphenols in the plant kingdom. They are also associated to many of the beneficial effects of plant-based food and diet, especially in cardiovascular health. Among them, epicatechin, a flavonoid from the flavan-3-ols family is known for its antioxidant or anti-inflammatory properties and capacity to protect from a range of dysfunctions related to chronic diseases. Hemostasis, which contributes to the pathophysiology of cardiometabolic diseases, could also be modulated by flavonoids. The first part of this thesis was to study the impact of epicatechin on the three main stages of hemostasis which are primary hemostasis, plasma coagulation and fibrinolysis, using global tools to identify the hemostatic phenotype induced by epicatechin. We have shown that epicatechin at high concentration inhibits platelet function and modulates the coagulant and fibrinolytic profile. In the second part, we tried to determine the effect of epicatechin on microparticles and their procoagulant functions. While the overall microparticle concentration is not impacted by epicatechin, the latter appears to attenuate their procoagulant potential when detected by the formation of thrombin. Finally in the third part, we studied the final process of fibrin clot formation. Using microscopy, spectrophotometric and functional techniques, we were able to determine that the clot formed in the presence of epicatechin is less dense and more permeable. These in vitro data have yet to be confirmed in vivo to objectify the impact of epicatechin and its metabolites at concentrations reachable through dietary intakes.Les flavonoïdes sont les polyphénols les plus largement répandus dans le règne végétal. Ils sont également à l’origine de nombreux effets bénéfiques liés à l’alimentation notamment dans la santé cardiovasculaire. Parmi eux, l’épicatéchine, un flavonoïde de la famille des flavan-3-ols est connu pour ses propriétés antioxydantes ou anti-inflammatoires. L’hémostase, qui participe à la physiopathologie des maladies cardiométaboliques pourrait également être modulée par les flavonoïdes. La première partie de ces travaux de thèse a consisté à étudier l’impact de l’épicatéchine sur les trois principales étapes de l’hémostase que sont l’hémostase primaire, la coagulation plasmatique et la fibrinolyse, grâce à des outils globaux, afin de tenter de dégager le phénotype hémostatique induit par l’épicatéchine. Nous avons pu montrer qu’à forte concentration l’épicatéchine inhibe la fonction plaquettaire et module le profil coagulant et fibrinolytique. Dans la deuxième partie, nous avons tenté de déterminer l’effet de l’épicatéchine sur les microparticules et leurs fonctions procoagulantes. Alors que la concentration globale en microparticules n’est pas impactée par l’épicatéchine, cette dernière semble atténuer leur potentiel procoagulant lorsqu’il est détecté par la formation de thrombine. Enfin dans la troisième partie, nous avons étudié le processus final de formation du caillot de fibrine. Par des techniques de microscopie, spectrophotométrique et fonctionnelle nous avons pu déterminer que le caillot formé en présence d’épicatéchine est moins dense et plus perméable. Ces données in vitro restent encore à être confirmées in vivo afin d’objectiver l’impact de l’épicatéchine et de ses métabolites à des concentrations compatibles avec l’alimentation

Impact de l’épicatéchine sur l’hémostase et la structure du caillot de fibrine

Flavonoids are the most widespread polyphenols in the plant kingdom. They are also associated to many of the beneficial effects of plant-based food and diet, especially in cardiovascular health. Among them, epicatechin, a flavonoid from the flavan-3-ols family is known for its antioxidant or anti-inflammatory properties and capacity to protect from a range of dysfunctions related to chronic diseases. Hemostasis, which contributes to the pathophysiology of cardiometabolic diseases, could also be modulated by flavonoids. The first part of this thesis was to study the impact of epicatechin on the three main stages of hemostasis which are primary hemostasis, plasma coagulation and fibrinolysis, using global tools to identify the hemostatic phenotype induced by epicatechin. We have shown that epicatechin at high concentration inhibits platelet function and modulates the coagulant and fibrinolytic profile. In the second part, we tried to determine the effect of epicatechin on microparticles and their procoagulant functions. While the overall microparticle concentration is not impacted by epicatechin, the latter appears to attenuate their procoagulant potential when detected by the formation of thrombin. Finally in the third part, we studied the final process of fibrin clot formation. Using microscopy, spectrophotometric and functional techniques, we were able to determine that the clot formed in the presence of epicatechin is less dense and more permeable. These in vitro data have yet to be confirmed in vivo to objectify the impact of epicatechin and its metabolites at concentrations reachable through dietary intakes.Les flavonoïdes sont les polyphénols les plus largement répandus dans le règne végétal. Ils sont également à l’origine de nombreux effets bénéfiques liés à l’alimentation notamment dans la santé cardiovasculaire. Parmi eux, l’épicatéchine, un flavonoïde de la famille des flavan-3-ols est connu pour ses propriétés antioxydantes ou anti-inflammatoires. L’hémostase, qui participe à la physiopathologie des maladies cardiométaboliques pourrait également être modulée par les flavonoïdes. La première partie de ces travaux de thèse a consisté à étudier l’impact de l’épicatéchine sur les trois principales étapes de l’hémostase que sont l’hémostase primaire, la coagulation plasmatique et la fibrinolyse, grâce à des outils globaux, afin de tenter de dégager le phénotype hémostatique induit par l’épicatéchine. Nous avons pu montrer qu’à forte concentration l’épicatéchine inhibe la fonction plaquettaire et module le profil coagulant et fibrinolytique. Dans la deuxième partie, nous avons tenté de déterminer l’effet de l’épicatéchine sur les microparticules et leurs fonctions procoagulantes. Alors que la concentration globale en microparticules n’est pas impactée par l’épicatéchine, cette dernière semble atténuer leur potentiel procoagulant lorsqu’il est détecté par la formation de thrombine. Enfin dans la troisième partie, nous avons étudié le processus final de formation du caillot de fibrine. Par des techniques de microscopie, spectrophotométrique et fonctionnelle nous avons pu déterminer que le caillot formé en présence d’épicatéchine est moins dense et plus perméable. Ces données in vitro restent encore à être confirmées in vivo afin d’objectiver l’impact de l’épicatéchine et de ses métabolites à des concentrations compatibles avec l’alimentation

Impact of epicatechin on hemostasis and fibrin clot structure

Les flavonoïdes sont les polyphénols les plus largement répandus dans le règne végétal. Ils sont également à l’origine de nombreux effets bénéfiques liés à l’alimentation notamment dans la santé cardiovasculaire. Parmi eux, l’épicatéchine, un flavonoïde de la famille des flavan-3-ols est connu pour ses propriétés antioxydantes ou anti-inflammatoires. L’hémostase, qui participe à la physiopathologie des maladies cardiométaboliques pourrait également être modulée par les flavonoïdes. La première partie de ces travaux de thèse a consisté à étudier l’impact de l’épicatéchine sur les trois principales étapes de l’hémostase que sont l’hémostase primaire, la coagulation plasmatique et la fibrinolyse, grâce à des outils globaux, afin de tenter de dégager le phénotype hémostatique induit par l’épicatéchine. Nous avons pu montrer qu’à forte concentration l’épicatéchine inhibe la fonction plaquettaire et module le profil coagulant et fibrinolytique. Dans la deuxième partie, nous avons tenté de déterminer l’effet de l’épicatéchine sur les microparticules et leurs fonctions procoagulantes. Alors que la concentration globale en microparticules n’est pas impactée par l’épicatéchine, cette dernière semble atténuer leur potentiel procoagulant lorsqu’il est détecté par la formation de thrombine. Enfin dans la troisième partie, nous avons étudié le processus final de formation du caillot de fibrine. Par des techniques de microscopie, spectrophotométrique et fonctionnelle nous avons pu déterminer que le caillot formé en présence d’épicatéchine est moins dense et plus perméable. Ces données in vitro restent encore à être confirmées in vivo afin d’objectiver l’impact de l’épicatéchine et de ses métabolites à des concentrations compatibles avec l’alimentation.Flavonoids are the most widespread polyphenols in the plant kingdom. They are also associated to many of the beneficial effects of plant-based food and diet, especially in cardiovascular health. Among them, epicatechin, a flavonoid from the flavan-3-ols family is known for its antioxidant or anti-inflammatory properties and capacity to protect from a range of dysfunctions related to chronic diseases. Hemostasis, which contributes to the pathophysiology of cardiometabolic diseases, could also be modulated by flavonoids. The first part of this thesis was to study the impact of epicatechin on the three main stages of hemostasis which are primary hemostasis, plasma coagulation and fibrinolysis, using global tools to identify the hemostatic phenotype induced by epicatechin. We have shown that epicatechin at high concentration inhibits platelet function and modulates the coagulant and fibrinolytic profile. In the second part, we tried to determine the effect of epicatechin on microparticles and their procoagulant functions. While the overall microparticle concentration is not impacted by epicatechin, the latter appears to attenuate their procoagulant potential when detected by the formation of thrombin. Finally in the third part, we studied the final process of fibrin clot formation. Using microscopy, spectrophotometric and functional techniques, we were able to determine that the clot formed in the presence of epicatechin is less dense and more permeable. These in vitro data have yet to be confirmed in vivo to objectify the impact of epicatechin and its metabolites at concentrations reachable through dietary intakes

Etude du phénotype et du rôle procoagulant des microparticules – Impact de l’épicatéchine

National audienc

Mise en place d'une technique de thrombinographie (application à une population témoin et cirrhotique)

La cirrhose s'accompagne d'une baisse de la majorité des facteurs de la coagulation qu'ils soient procoagulants ou anticoagulants. L'allongement des tests classiques de la coagulation tels que le Temps de Quick ou le Temps de Céphaline Activé a longtemps fait considérer les patients cirrhotiques comme naturellement 'anticoagulé" et donc potentiellement à risque hémorragique. Cependant ces tests ne sont pas adaptés pour l'exploration des déficits en molécules anticoagulantes comme l'antithrombine, la protéine C ou la protéine S et ne peuvent donc pas donner une vue globale de la coagulation d'un patient. Dans ce contexte, la thrombinographie est un test potentiellement intéressant pour explorer les variations combinées des facteurs procagulants et anticoagulant. Notre étude a consisté à adapter cette technique au sein du laboratoire, à l'évaluer puis à l'optimiser pour qu'elle reflète au mieux les phénomènes de la coagulation in vivo. Pour cela nous avons entrepris d'adjoindre à la thrombinographie un activateur du système de la protéine C / protéine S, la thrombomoduline ou la Protéine C activée. Différentes manipulations ont permis de déterminer une concentration optimale de 3.6 nmol/L de TM et 1 nmol/L de PCa. Dans ses conditions, la thrombinographie devenait capable d'explorer les variations des facteurs procoagulants comme anticoagulants et notamment l'action de la PCa. Nous avons également mené une étude descriptive de la thrombinographie chez 9 patients cirrhotiques et 15 témoins sains. Nous avons notamment mesuré le potentiel endogène de thrombine. Nous avons mis en évidence des ETP augmentés chez les patients cirrhotiques par rapport aux témoins, notamment dans la configuration incluant de la TM. Ces résultats étaient confirmés par un ratio d'inhibition fortement en faveur d'une hypercoagulabilité. Une étude au cours du temps (3 mois) a confirmé la stabilité des principaux paramètres de la thrombinographie chez les témoins comme chez les patients cirrhotiques. Au final, en accord avec les données épidémiologiques qui mettent en évidence un risque de thrombose important, ces résultats remettent en question l'état d'hypocoagulabilité des patients cirrhotiques. Bien qu'ayant besoin d'être confirmé sur de plus larges cohortes, ces résultats pourraient avoir des conséquences sur la prise en charge prophylactique et curative chez ces patients.CLERMONT FD-BCIU-Santé (631132104) / SudocLYON1-BU Santé (693882101) / SudocSudocFranceF

Monitoring heparin therapy: stability of two different anti-Xa assays using blood samples collected in citrate-containing and CTAD tubes

Anti-factor Xa assays and activated partial thromboplastin time (aPTT) are mainly employed to monitor patients treated with heparins. According to the Clinical and Laboratory Standards Institute and the French Working Group on Haemostasis and Thrombosis, anti-factor Xa activity and aPTT should be tested within 2 h of blood sampling for unfractionated heparin (UFH) monitoring. However, discrepancies exist depending on the used reagents and collecting tubes. The study aim was to determine the stability of aPTT and anti-factor Xa measurements using blood samples collected in citrate-containing or citrate-theophylline-adenosine-dipyridamole (CTAD) tubes and stored for up to 6 h. Methods Patients receiving UFH or low molecular weight heparin (LMWH) were enrolled; aPTT and anti-factor Xa activity were tested using two different analyser/reagent pairs (Stago and reagent without dextran sulfate; Siemens and reagent with dextran sulfate) after 1, 4 and 6 h of sample storage as whole blood or as plasma. Results For UFH monitoring, comparable anti-factor Xa activity and aPTT results were obtained with both analyser/reagent pairs when samples were stored as whole blood before plasma isolation. With samples stored as plasma, anti-factor Xa activity and aPTT were not affected up to 6 h after sampling when using the Stago/no-dextran sulfate reagent pair. With the Siemens/dextran sulfate-containing reagent, aPTT was significantly altered after 4 h of storage. For LMWH monitoring, anti-factor Xa activity remained stable (whole blood and plasma) for at least 6 h. Results were comparable with citrate-containing and CTAD tubes. Conclusions Anti-factor Xa activity in samples stored as whole blood or plasma was stable for up to 6 h, regardless of the reagent (with/without dextran sulfate)/collection tube. Conversely, aPTT was more variable because other plasma parameters can influence its measure and complicate the interpretation of its variations after 4 h

Effect of tube filling on plasma freezing for coagulation testing

International audienceBackground: Storage of frozen plasma samples for hemostasis testing is a key step to obtain reliable results. Variables that can affect the quality of plasma during storage include the cryotube type and volume and the tube filling level that conditions the residual air volume. To date, there are only few data on which to base recommendations.Objectives: The aim of this study was to investigate the influence of the tube filling volume (20%, 40%, and 80%) of 2-mL microtubes on frozen plasma for a large panel of hemostasis assays.Methods: For this study, 85 subjects were included, and blood samples were collected from them by venipuncture. After double centrifugation, each sample was aliquoted in 3 2-mL microtubes with different volumes (0.4, 0.8, and 1.6 mL) and stored at - 80. C. At the end of the frozen storage period (3 months +/- 1 week), all aliquots from the sample were tested in the same analytical series for a large panel of hemostasis analyses.Results: Compared with completely filled microtubes (1.6/2 mL), storing frozen plasma in smaller volumes (0.4/2 mL) significantly decreased prothrombin time and activated partial thromboplastin time. Conversely, factor II, V, VII, and X levels were increased. Antithrombin, Russell's viper venom time, and anti-Xa activity in patients treated with heparin were also increased.Conclusion: To store plasma at -80. C for hemostasis analysis, samples should be frozen in small-volume microtubes (<2 mL) with screw caps that are filled to 80% of their volume

In vitro assessment of edoxaban anticoagulant effect in pediatric plasma

Epub ahead of printINTRODUCTION: Anticoagulant therapy in pediatric patients remains an issue and safer therapies, such as direct oral anticoagulants could overcome the limitations of conventional anticoagulant treatments in this population. Edoxaban, a factor Xa inhibitor, is used for the prevention and treatment of venous thromboembolism. Due to its pharmacokinetic characteristics, edoxaban is a promising candidate molecule for children. This study compared edoxaban in vitro effect in children and adults. MATERIALS AND METHODS: Blood samples were prospectively collected from 87 adults and 97 children (n=12: <2year-old; n=8: 2-4year-old; n=9: 5-7year-old; n=14: 8-9year-old; n=10: 10-13year-old; n=15: 14-15year-old; and n=29: 16-18year-old). Plasma samples were supplemented in vitro with edoxaban to a final concentration of 50, 150 or 300ng/mL, and then edoxaban effect on prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (aPTT), fibrinogen (Clauss assay), specific anti-factor Xa activity and thrombin generation assay (TGA) (with 5pM tissue factor and 4nM phospholipids) was evaluated. RESULTS: PT, aPTT, and specific anti-Xa activity exhibited similar dose-dependent responses to edoxaban in the different age groups. The reduction of thrombin peak, the most edoxaban-sensitive TGA parameter, was similar in adults and children, but for the youngest group (<2year-old) where the peak value reduction (median [Q1-Q3]) was higher than in adults (51% [44-59] versus 40% [32-46], p<0.01; 74% [63-80] versus 65% [58-70], p<0.05; and 84% [73-88] versus 76% [70-80], p<0.05 for 50, 150 and 300ng/mL edoxaban, respectively). CONCLUSIONS: Edoxaban in vitro effect are comparable in children and adults except in the <2-year-old group

Thrombin Generation and Cirrhosis: State of the Art and Perspectives

International audienceEpidemiological and laboratory studies performed in the last decades have changed our understanding of coagulopathy in cirrhosis, from a condition at increased risk of hemorrhagic events to one at higher thrombotic risk. However, it is not clear whether the decrease in factors that promote (except factor [F] VIII) versus inhibit coagulation in patients with cirrhosis results in a rebalanced state or in a hypercoagulable phenotype. This issue can be partially addressed using thrombin generation assays (TGA), which unlike routine clotting tests (prothrombin time or activated partial thromboplastin time) are sensitive to both procoagulant factors and coagulation inhibitors. However, many preanalytical issues and variable analytical methodologies used in TGAs complicate data analysis and interlaboratory comparisons. The introduction of TGAs in which activators of the protein C pathway (particularly soluble forms of thrombomodulin [TM]) are added has allowed detection of a reduced anticoagulant effect of TM or even a hypercoagulable phenotype as judged by endogenous thrombin potential. However, inter- and intra-assay variability may be greater with this TGA variant compared with "standard" TGAs. TGAs also allowed identifying main determinants of the hypercoagulability phenotype in the presence of TM: acquired antithrombin and protein C deficiencies, and elevated FVIII levels. The aim of this narrative review is to summarize the preanalytical and methodological variables of TGAs and also the findings of the main studies that have evaluated TGAs in patients with cirrhosis. The review also provides some propositions for future studies and outlines some perspectives on the potential implementation of this promising tool in clinical practice for the study of coagulation in patients with cirrhosis