Tiras reactivas acopladas a Smartphones para el control de tiramina en alimentos: condiciones de inmovilización

La presencia de tiramina en algunos alimentos, como ciertos quesos y pescados, puede llegar a resultar tóxica. Es por este motivo que resulta necesario el desarrollo de un método rápido de determinación de esta amina biógena. Con el objetivo de mejorar la determinación de tiramina a través de tiras reactivas, este trabajo pretende estudiar las condiciones óptimas de inmovilización de los reactivos necesarios para la misma. Este procedimiento está basado en el acoplamiento de dos reacciones enzimáticas. En la primera reacción, la tiramina es oxidada a su correspondiente aldehído por acción de la enzima tiramina oxidasa (TAO). En la segunda reacción enzimática, el H2O2 también obtenido en la reacción anterior, es reducido a H2O en presencia de la enzima peroxidasa (HRP). Esta enzima revierte a su forma reducida, oxidando al colorante 3,3’,5,5’-tetrametilbencidina (TMB), que pasa de ser incoloro a presentar una coloración azul cuando está oxidado. Es este cambio en las propiedades ópticas del TMB lo que permite realizar un seguimiento de la reacción; esto se lleva a cabo a través de una aplicación en el smartphone, teniendo de esta forma un sistema autónomo para medidas in situ.El estudio de la reacción se realizará en soportes sólidos de celulosa, en los cuales se inmovilizan los reactivos, actuando como tiras reactivas. Se estudiará cómo afectan a la determinación de tiramina distintos parámetros, tales como el pH, la concentración de HRP, TAO, el orden de inmovilización, el % de celulosa o el uso de estabilizantes.<br /

Test rápido enzimático para la determinación de alcohol

Se pretende desarrollar un método analítico para la determinación de etanol de forma rápida en soportes de celulosa. En primer lugar, se estudia mediante fluorescencia la oxidación de etanol a acetaldehído mediante la enzima ADH, utilizando NAD+ como cofactor. El seguimiento de esta reacción se realiza a las longitudes de onda de absorción y fluorescencia del NADH, 340 y 450nm respectivamente. Con este método se ha conseguido un rango lineal muy bajo. Para aumentar el rango lineal, se implanta una segunda reacción enzimática. Se trata de una reacción indicadora en la cual, debido a la enzima diaforasa se oxida el NADH generado en la reacción anterior. A su vez, se produce la reducción de un colorante produciéndose así un compuesto coloreado. Esta reacción se estudia a la longitud de onda de absorción del colorante (490nm). Una vez optimizado el método analítico para la determinación de etanol en disolución y comprobado que es posible utilizar esta metodología para el desarrollo de un biosensor enzimático, se han dado los primeros pasos en la construcción de un soporte sólido para la determinación de etanol de forma rápida. Para ello, se han inmovilizado el colorante, el cofactor NAD y las enzimas ADH y diaforasa en soportes sólidos de celulosa. Se ha comprobado que pueden observarse diferentes señales variando parámetros como pH, concentración de ADH y que dependen de la concentración de etanol.<br /

Desarrollo de un método óptico enzimático para la determinación de alcaloides tropánicos.

Se pretende desarrollar un método analítico rápido para la determinación de alcaloides de tropano, concretamente atropina. El inicio se basa en la oxidación alcalina de la atropina para obtener tropina por la acción de una disolución de NaOH 2M. Posteriormente, se estudia mediante absorción molecular la oxidación del grupo alcohol a una cetona de la molécula de tropina mediante la enzima Tropinona Reductasa, utilizando el NAD+ como cofactor. El seguimiento de esta reacción se realiza a la longitud de onda de 340 nm, el máximo de absorción del NADH, que es proporcional a la tropina.Para aumentar el rango lineal, se acopla una segunda reacción enzimática. Se trata de una reacción colorimétrica en la cual, mediante la enzima diaforasa se oxida el NADH generado en la reacción anterior. A su vez, se produce la reducción de un colorante produciéndose así un compuesto con un color rojizo. Esta reacción se estudia a la longitud de onda de absorción del colorante, 490 nm, que es proporcional a la concentración de atropina.Una vez optimizado el método analítico para la determinación de alcaloides de tropano en disolución, se realizan las primeras pruebas en muestras reales y se lleva a cabo el estudio del efecto matriz que conllevan las muestras de cereales para alimentación infantil más habituales.Se obtiene un LD=7,10·10-7 M, un LQ= 2,37·10-6 M, un rango lineal desde el LQ hasta C= 1·10-4 M y una DSR=3,84%. Este es un primer paso para el estudio de la reacción en un soporte sólido para desarrollo de biosensores.<br /

Analytical possibilities of Putrescine and Cadaverine enzymatic colorimetric determination in tuna based on diamine oxidase: A critical study of the use of ABTS

The joint determination of putrescine (Put) and cadaverine (Cad) in the presence of other biogenic amines is studied using their enzymatic reaction with diamine oxidase (DAO). Three alternative methods are studied based on the intrinsic colorimetric properties of DAO or horseradish peroxidase (HRP), and the use of 2, 2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS) colorimetric reagent, respectively. In this last case an in-depth study is carried out in order to explain and solve some drawbacks usually associated with the use of this reagent (especially interferences, interaction with enzymes and instability), and to propose new analytical methodologies which this reagent allows to achieve (transient signal and the use of the violet species). Finally, the method has been applied to Put + Cad determination in a tuna sample without interference of other biogenic amines. The result has been compared with that obtained using a method based on HPLC-MS, which has allowed the new methodology to be validated

Desarrollo de tiras reactivas para la determinación de histamina en alimentos

Las aminas biógenas (AB) son biomoléculas formadas por la descarboxilación deaminoácidos tras la acción de enzimas microbianas. Una concentración elevada de AB en losalimentos causa intoxicaciones y está asociada al de deterioro del alimento. Por tanto, sonindicadores importantes para la calidad y seguridad alimentarias. La determinación de ABmediante métodos convencionales con técnicas como la cromatografía (HPLC), precisatratamientos previos de la muestra y sus equipos suponen un coste elevado.En este trabajo se propone un método alternativo más rápido y económico para ladeterminación de histamina, la única AB con límites legales y una de las más tóxicas. El métodoconsiste en inmovilizar sobre soportes de celulosa la reacción de histamina con la enzima TAOen presencia de un colorante y HRP, que reacciona con el H2O2 formado en la primera reacción.En pocos minutos se genera un compuesto de color rosa medible fácilmente con una aplicaciónde Smartphone.Para ello se estudió primero el método en disolución. Luego se optimizó la inmovilizaciónde los reactivos en los soportes y tras lograr una señal reproducible de H2O2 e histamina, seobtuvieron las curvas de calibrado de ambos. Se consiguió el objetivo de obtener una señaldependiente de la concentración de histamina.Más adelante se realizó un estudio de interferencias con otras aminas. Tras comprobar quela tiramina interfiere en la señal de histamina, se obtuvo también su curva de calibrado, quepresenta una cinética de reacción distinta a la de histamina. Ante este hecho, se realizó unensayo de determinación conjunta de ambas, en el cual se consiguieron buenos resultados enla estimación de las dos concentraciones.Aunque la investigación debe continuar para mejorar la sensibilidad y reproducibilidad, losresultados obtenidos sugieren que estas tiras reactivas pueden llegar a ser un interesantemétodo alternativo para histamina<br /

Aportación de la cromatografía en capa fina de alta eficacia acoplada a espectrometría de masas y de la fluorescencia de flavoenzimas a la lipidómica y a otros problemas del análisis de lípidos

La Lipidómica hace referencia a la disciplina de investigación basada en el análisis de las especies lipídicas, e incluye la identificación y cuantificación de los miles de especies moleculares de lípidos celulares en sistemas biológicos. Los avances en tecnología analítica, especialmente en Espectrometría de Masas (MS) han impulsado la investigación en Lipidómica y la del análisis de lípidos en matrices de interés industrial relacionadas con la alimentación y la bioenergía. Aunque la plataforma más utilizada es sin duda el acoplamiento con la Cromatografía Líquida de Alta Eficacia en Columna, con ionización de tipo electrospray, LC-MS (ESI), no hay un único esquema basado en MS que pueda cubrir la detección del lipidoma completo, debido a la diversidad de las estructuras moleculares existentes. En esta Tesis se ha evaluado la aportación de dos técnicas y se han desarrollado nuevas metodologías analíticas para el análisis de diferentes clases de lípidos en muestras complejas que proceden de matrices diferentes utilizando dos enfoques distintos.Por un lado, para el análisis de las especies moleculares individuales de diferentes clases de esfingolípidos (SL) en plasma humano, lípidos neutros (LN) y ácidos grasos (FA) en biodiésel, y fosfolípidos (PL) en extractos de membranas bacterianas y su complejo purificado, se ha llevado a cabo el desarrollo de la técnica de Cromatografía en Capa Fina de Alta Eficacia acoplada a técnicas tándem MS (HPTLC-MSn) y de alta resolución HRMS. Desde una misma placa cromatográfica se obtiene:• una separación en clases de lípidos• perfiles semicuantitativos dentro de cada clase de lípidos por ESI-MS • determinación estructural inequívoca y directa de los lípidos individuales y sus especies moleculares por tamden MS/HRMSSe demuestra que esta técnica tiene especial interés en la caracterización rápida de bandas diana en la zona deseada de la placa. La selectividad espacial proporcionada por la técnica la hace complementaria a LC-MS. Otras ventajas son alta capacidad de tratamiento de un elevado número de muestras simultáneamente, desarrollo paralelo de muestras y patrones y bajo coste relativo en tiempo y disolvente. Tradicionalmente el enfoque MS/MS no se había desarrollado en HPTLC debido a que la formación conjunta de especies sodiadas y protonadas complicaba la interpretación de los espectros. Los aductos de sodio de los espectros ESI-MS pueden ser fragmentados en modo ESI+ usando tecnologías de trampa de iones y cuadrupolo TOF. El sodio permanece como carga de los iones producto siendo este hecho útil para la identificación de las estructuras de los lípidos. Los espectros se obtienen de manera rápida, fiable y sencilla a partir de las bandas separadas en la placa mostrando buena intensidad y calidad.Por otro lado, buscando selectividad hacia un único analito se ha desarrollado una metodología analítica basada en la fluorescencia de las flavoenzimas, que permite la determinación de fosfolípidos que contienen colina, como la fosfatidilcolina (PC). Si sobre ella actúa la lipasa (PLC) se obtiene fosforilcolina (ChoP) que a su vez reacciona con la enzima fosfatasa alcalina (AP) obteniendo colina (Ch). PLC AP ChOxPC-------->ChoP--------->Ch--------->betaina+H2O2La enzima colina oxidasa (ChOx) es una flavoenzima que cambia sus propiedades ópticas durante su reacción con Ch, hecho que se puede utilizar para la determinación de PC o sus metabolitos sin la necesidad de añadir más reactivos que los involucrados en la reacción. En esta tesis esta metodología se aplica a la determinación de ChoP y Ch en muestras de leche infantil poniendo de manifiesto las posibilidades de la técnica:• dependiendo del interés se puede hacer la determinación secuencial o simultánea simplemente cambiando el orden de adición de los reactivos• puesto que la selectividad la aportan las reacciones enzimáticas el tratamiento de muestra es corto y sencillo.• la metodología se ha desarrollado en un lector de placas de pocillos por lo que es muy económico• las interferencias espectrales se evitan de forma sencilla modificando químicamente la enzima para trabajar a longitudes de onda adecuadas.• puesto que las enzimas se regeneran se pueden desarrollar sensores, para lo que se deben inmovilizar en los soportes adecuados. Se eligió un soporte basado en gel de acrilamida pudiéndose desarrollar un sensor tanto para colina como para fosfato de colina.<br /

Desarrollo de tiras reactivas colorimétricas para la determinación de aminas biógenas

Las aminas biógenas (AB) se definen como compuestos nitrogenados, de bajo peso molecular e importante actividad biológica. Estas aminas se originan principalmente por descarboxilación de aminoácidos o proteínas; y pueden ser elaboradas dentro de nuestro organismo (endógenas) o proceder de otras fuentes como los alimentos (exógenas). Las AB endógenas se forman en distintos tipos de tejidos del organismo y a través de torrente sanguíneo son difundidas a otras zonas para desempeñar distintas funciones fisiológicas. Por otro lado, las AB exógenas se forman por la acción de ciertas enzimas en el tejido de los alimentos o por los microorganismos que los contaminan. Las AB más importantes son la histamina, putrescina, cadaverina y tiramina. De éstas, la histamina es la que mayor poder toxicológico presenta, pudiéndose exacerbar su toxicidad por la presencia de otras AB. El organismo posee herramientas para su degradación y eliminación. Esta degradación se lleva a cabo a través de ciertas enzimas presentes en las células intestinales y hepáticas, como son la monoamino oxidasa (MAO), diamino oxidasa (DAO) y la poliamino oxidasa (PAO), pero muchas veces su actividad no es suficiente. La ingesta de cantidades elevadas de AB puede producir intoxicaciones, cuyo cuadro clínico se desarrolla, entre otros, con dolores de cabeza, cólicos, erupciones, etc. Actualmente, sólo están legislados los niveles máximos de histamina para ciertos alimentos, sin embargo, esta siempre va acompañada de otras AB. Es por eso que se necesita desarrollar un método rápido y de fácil uso para la detección precoz de estas aminas. Para cumplir este propósito, hemos propuesto un método semicuantitativo basado en tiras reactivas que permite, a través de una aplicación móvil, relacionar directamente la concentración de AB con las propiedades colorimétricas de una reacción enzimática

Downregulation of A20 Expression Increases the Immune Response and Apoptosis and Reduces Virus Production in Cells Infected by the Human Respiratory Syncytial Virus

Human respiratory syncytial virus (HRSV) causes severe lower respiratory tract infections in infants, the elderly, and immunocompromised adults. Regulation of the immune response against HRSV is crucial to limiting virus replication and immunopathology. The A20/TNFAIP3 protein is a negative regulator of nuclear factor kappa B (NF-kB) and interferon regulatory factors 3/7 (IRF3/7), which are key transcription factors involved in the inflammatory/antiviral response of epithelial cells to virus infection. Here, we investigated the impact of A20 downregulation or knockout on HRSV growth and the induction of the immune response in those cells. Cellular infections in which the expression of A20 was silenced by siRNAs or eliminated by gene knockout showed increased inflammatory/antiviral response and reduced virus production. Similar results were obtained when the expression of A20-interacting proteins, such as TAX1BP1 and ABIN1, was silenced. Additionally, downregulation of A20, TAX1BP1, and ABIN1 increased cell apoptosis in HRSV-infected cells. These results show that the downregulation of A20 expression might contribute in the control of HRSV infections by potentiating the early innate immune response and increasing apoptosis in infected cells.S

Solving Color Reproducibility between Digital Devices: A Robust Approach of Smartphones Color Management for Chemical (Bio)Sensors

In the past twelve years, digital image colorimetry (DIC) on smartphones has acquired great importance as an alternative to the most common analytical techniques. This analysis method is based on fast, low-cost, and easily-accessible technology, which can provide quantitative information about an analyte through the color changes of a digital image. Despite the fact that DIC is very widespread, it is not exempt from a series of problems that are not fully resolved yet, such as variability of the measurements between smartphones, image format in which color information is stored, power distribution of the illuminant used for the measurements, among others. This article proposes a methodology for the standardization and correction of these problems using self-developed software, together with the use of a 3D printed light box. This methodology is applied to three different colorimetric analyses using different types and brands of smartphones, proving that comparable measurements between devices can be achieved. As color can be related to many target analytes, establishing this measurement methodology can lead to new control analysis applicable to diverse sectors such as alimentary, industrial, agrarian, or sanitary

Portable colorimetric enzymatic disposable biosensor for histamine and simultaneous histamine/tyramine determination using a smartphone

Tyramine oxidase (TAO), peroxidase (HRP), and Amplex Red (AR) have been immobilized on cellulose to obtain disposable biosensors for the determination of histamine. During the enzymatic reaction, AR is oxidized and a pink spot is obtained. Using a smartphone and measuring the G (green) color coordinate, histamine can be determined in the presence of other biogenic amines (putrescine and cadaverine) in concentrations ranging from 2·10−5 M to 5·10−4 M with a 7.5·10−6 M limit of detection (LoD). Despite tyramine interference, experimental conditions are provided which allow rapid and simple histamine and simultaneous histamine/tyramine (semi)quantitative determination in mixtures. Finally, tyramine and histamine were determined in a tuna extract with good results (compared to the reference HPLC–MS method). The methodology can also be applied in solution allowing histamine (and simultaneous histamine/tyramine) determination with a lower LoD (1.8·10−7 M) and a similar selectivity