Streaming acoustique dans un puits de culture cellulaire : application à la sonoporation

Le phénomène de sonoporation est intimement lié à l'interaction entre une cellule et une bulle de cavitation. Pour obtenir une information sur le caractère spatial de la cavitation ultrasonore générée, et en vue de la transfection de cellules adhérentes dans un puits de culture biologique, cette étude vise à caractériser le champ acoustique et le streaming dans une cavité non rectangulaire. Pour ce faire, des particules fluorescentes (3µm) sont utilisées sous microscope et permettent de quantifier le champ de déplacement au voisinage de la paroi

Feedback loop process to control acoustic cavitation : application to cell transfection

Le travail présenté ici porte sur l’étude et le contrôle de la cavitation acoustique dans le but de développer un système de sonoporation efficace pour les cellules en suspension et les cellules adhérentes. Le manuscrit est composé de trois chapitres. Tout d’abord, une revue de la littérature sur les différentes techniques physiques utilisées en transfection cellulaire, et plus particulièrement la sonoporation. Il a été démontré que le principal mécanisme de la sonoporation est étroitement lié au phénomène de cavitation acoustique. Un contrôle de ce phénomène aléatoire apparaît alors intéressant afin d’augmenter le taux de transfection tout en gardant une forte viabilité cellulaire. Dans le second chapitre, un système de régulation de cavitation ultrasonore basé sur un indice acoustique de cavitation a été étudié. Cet indice, est basé sur la mesure de bruit large bande émis lors de l’implosion des bulles de cavitation. Les avantages d’un tel système sont : un suivi en temps réel du niveau de cavitation durant l’irradiation, des informations quasi-instantanées sur les composantes spectrales caractéristiques de la cavitation, une meilleure reproductibilité et stabilité du niveau de cavitation surtout pour les intensités modérés. Dans le troisième chapitre, pour comprendre les mécanismes de la sonoporation, un deuxième système de cavitation contrôlé a été conçu dans le but de permettre une visualisation du milieu en cours d’insonification. Ce nouveau dispositif est adapté à un fonctionnement sous microscope photonique à transmission et à fluorescence. Des essais de transfection de siRNAs, sur les cellules en suspension (RL du lymphome folliculaire) et sur les cellules adhérentes (cancer du sein ; MDA-MB 231) ont permis de valider in vitro l’efficacité de ce système en atteignant un taux de 40 % de transfection pour ces deux types de cellules, avec un très faible taux de mortalité (< 10 %)The aim of the present work, which is based on the study and the control of acoustic cavitation, is to develop an efficient sonoporation system to transfect the cells in suspension and the adherent cells. The manuscript is composed of three chapters. The first one takes a glance on the state of art of different physical techniques used in cells transfection, and more precisely on sonoporation. It has been shown that the principal mechanism of sonoporation is closely linked to acoustic cavitation. Thus, a control of this random phenomenon is important to increase the rate of transfection while keeping strong cell viability. In the second chapter, a regulated cavitation generator based on an acoustic index was studied. This index is based on the measure of broad band noise emitted during the implosion of the cavitation bubbles. The advantage of such a system is: a control in real time of the level cavitation during sonication, leading to a better reproducibility and stability of the cavitation level, especially for the moderate intensities. In the third chapter, in order further study the sonoporation mechanisms, a second regulated cavitation generator was studied; its aim is to be able to visualize the medium during sonication. This new device is adapted to the performance under a fluorescencemicroscope with fluorescence transmission. SiRNAs transfection, was validated in vitro by attending a rate of 40 % of transfection for the two types of cells, with a very low rate of mortality (< 10%), for both suspended cells (RL of follicular lymphoma) and adherent cells (Cancer of breast; MDA-MB 231

Caractérisation d'un processus de régulation de la cavitation acoustique

National audienceLa cavitation acoustique est un phénomène stochastique, un niveau d'insonification fixé ne donnant pas lieu à une activité de cavitation reproductible ni régulière. Lors d'une insonification, des collapses inertiels de bulles peuvent apparaitre de manière intermittente, se traduisant par un bruit de fond sur les spectres du signal de réception, qui est un bon indicateur de la cavitation inertielle. Basé sur cet indicateur une méthode de contrôle dynamique du niveau de cavitation dans un milieu placé dans un champ ultrasonore stationnaire est proposée. Cette méthode consiste à maintenir un indice de cavitation CI, image de l'intensité de cavitation dans le milieu insonifié (Jhony El Maalouf, Ultrasonics 2008), au niveau de celui désiré par une boucle de rétroaction modulant l'intensité ultrasonore appliqué dans la plage comprise entre 0.2 et 3.44 W/cm2. Le dispositif expérimental est constitué d'un transducteur ultrasonore piézoélectrique plan (diamètre : 20 mm, fréquence 445 KHz), et d'un hydrophone récepteur du signal acoustique induit par la cavitation dans le milieu. L'apport d'un tel processus de contrôle est évalué par l'émission acoustique de la cavitation induite dans le milieu irradié (eau ou 2μM d'acide téréphtalique) et par la production de radicaux hydroxyles issus de la sonolyse du milieu (2μM d'acide téréphtalique). Le système de régulation permet de reproduire des indices de cavitation avec une variabilité inférieure à 3 % dans la plage des puissances appliquées, alors que, sans le contrôle de l'activité de la cavitation, cette variabilité peut atteindre 40 % en milieu de plage d'excitation ultrasonore. En conclusion, le générateur de cavitation régulé permet de reproduire parfaitement les niveaux de cavitation et cela indépendamment des faibles variations des conditions extérieures comme la température, et la pression atmosphérique. Ainsi, il apparait comme un outil très intéressant pour des applications de transfection in vitro