Ingénierie des glucane-saccharases de la famille 70 des glycoside-hydrolases pour la synthèse de nouveaux biopolymères

Les glucane-saccharases sont des transglucosidases de la famille 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d alpha -glucanes, polymères de haute masse molaire formés d unités glucosyle. Elles sont aussi capables de synthétiser des oligosaccharides ou glucoconjugués par réaction de transglucosylation sur des accepteurs exogènes de natures variées. De par la diversité de leurs spécificités, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées [alpha (1->2) ; alpha (1->3) ; alpha (1->4) ou alpha (1->6)] que de l organisation de ces liaisons au sein des produits formés, ces biocatalyseurs peuvent être mis à profit pour produire des hydrates de carbones d'intérêt pour les secteurs de l'alimentation, de la santé et de l'environnement. L'objectif de ces travaux de thèse était de générer par ingénierie enzymatique de nouvelles glucane-saccharases capables de synthétiser des alpha -glucanes et des gluco-oligosaccharides de structures et propriétés innovantes, afin d élargir le panel d'applications de ces molécules. Sur le plan fondamental, l'enjeu était aussi d'améliorer la compréhension des relations entre structure et spécificité des glucane-saccharases. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé une stratégie d'ingénierie combinatoire de la dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, qui catalyse la synthèse d un dextrane formé à 95 % de liaisons alpha (1->6) et 5 % alpha (1->3). Le travail a tout d'abord consisté à développer une méthode de criblage multi-étapes et à haut-débit, pour isoler et trier les variants de spécificités de liaisons variées. La stratégie comprend une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivie d un criblage par RMN 1D 1H automatisé au format microplaque. Il s'agit de la première méthode de criblage à haut-débit de la spécificité de liaison des transglucosidases et glycosyltransferases. Cette stratégie a ensuite été appliquée au criblage de deux banques de variants de la DSR-S, totalisant plus de 36 000 clones obtenus par mutagénèse de saturation et recombinaison simultanée de 8 résidus du domaine catalytique. Au total, 82 mutants capables de synthétiser entre 2 et 8 fois plus de liaisons alpha (1->3) par rapport à l enzyme parentale ont été isolés. La caractérisation des propriétés catalytiques de sept mutants représentatifs de la diversité de spécificité générée a permis d identifier un nouveau motif peptidique 460DYVHT464 impliqué dans la spécificité de DSR-S. Enfin, la caractérisation de la structure et des propriétés rhéologiques et mécaniques des dextranes synthétisés par ces 7 mutants a mis en évidence les différences de taille et de conformation de ces macromolécules en solution et révélé l aptitude du polymère synthétisé par le variant H463R/T464V/S512T à former des films bio-sourcés innovants, dont les propriétés mécaniques sont remarquables en comparaison de celles d'autres biopolymères extraits de plantes ou produits par fermentationGlucansucrases are transglucosidases from glycoside hydrolase family 70. From sucrose, these enzymes catalyse the synthesis of alpha -glucans, high molecular weight polymers formed of glucosyl units. Glucansucrases are also able to synthesize oligosaccharides or glucoconjugates by transglucosylation reaction onto various exogenous acceptors. Due to the large specificity, in terms of osidic linkages synthesized [alpha (1->2); alpha (1->3); alpha (1->4) or alpha (1->6)] and their organization within the formed products, these biocatalysts can be used to produce carbohydrates of interest in food, health and environment fields. The aim of this research work was to generate, by enzyme engineering, new glucansucrases able to synthesize alpha -glucans and gluco-oligosaccharides with novel structures and properties, to enlarge applications of these molecules. At fundamental level, the work was to improve the understanding of the relationships between structure and specificity of glucansucrases. To reach our objectives, we used a combinatorial engineering strategy on the dextransucrase DSR-S of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, which catalyses the synthesis of a dextran formed by 95 % of alpha (1->6) and 5 % alpha (1->3) linkages. The work consisted first in the development of a multi-step high throughput screening methodology to sort out and isolate variants with altered linkage specificities. The strategy includes a first stage of in vivo selection on solid medium followed by an automated 1D 1H NMR-based screening using microplates. To date, this is the first high-throughput screening method for linkage specificity determination of transglucosidases and glycosyltransferases. This strategy was applied to the screening of two DSR-S variants libraries, totalizing more than 36,000 clones obtained by saturation mutagenesis and simultaneous recombination of 8 residues from the catalytic domain. Eighty two mutants able of synthesize 2 to 8 times more alpha (1->3) linkages compared to the parental enzyme were isolated. The characterization of the catalytic properties of 7 representative mutants enabled the identification of a new peptide motif 460DYVHT464, involved in DSR-S specificity. Finally, the characterization of structural, rheological and mechanical properties of dextrans synthetized by these 7 mutants highlighted the differences in size and conformation of these macromolecules in solution and revealed the capacity of the polymer synthesized by H463R/T464V/S512T variant to form biofilms, whose mechanical properties are remarkable in comparison to those of other biopolymers extracted from plants or produced by fermentation.TOULOUSE-INSA-Bib. electronique (315559905) / SudocSudocFranceF

The price of informality : how informal finance schemes defaulted in China, 1989–2015.

The default of a large number of informal finance schemes in China has caused enormous financial losses, and therefore has potential social and political significance. Analysing 354 defaulted schemes from 1989 to 2015, this study defines how they differ from other types of informal finance. It also produces an ideal-type representation of the default process and concludes that the default results from greed, increasing financial pressure at the individual level and private enterprises’ restricted access to state bank loans at the institutional level. China’s financial system should be more flexible in order to prevent further financial losses through informal financial relations

Engineering glucansucrases from family 70 of glycoside-hydrolases for the synthesis of novel polysaccharides

Les glucane-saccharases sont des transglucosidases de la famille 70 des glycoside-hydrolases. A partir de saccharose, ces enzymes catalysent la synthèse d’alpha -glucanes, polymères de haute masse molaire formés d’unités glucosyle. Elles sont aussi capables de synthétiser des oligosaccharides ou glucoconjugués par réaction de transglucosylation sur des accepteurs exogènes de natures variées. De par la diversité de leurs spécificités, tant au niveau des liaisons osidiques synthétisées [alpha (1→2) ; alpha (1→3) ; alpha (1→4) ou alpha (1→6)] que de l’organisation de ces liaisons au sein des produits formés, ces biocatalyseurs peuvent être mis à profit pour produire des hydrates de carbones d'intérêt pour les secteurs de l'alimentation, de la santé et de l'environnement. L'objectif de ces travaux de thèse était de générer par ingénierie enzymatique de nouvelles glucane-saccharases capables de synthétiser des alpha -glucanes et des gluco-oligosaccharides de structures et propriétés innovantes, afin d’élargir le panel d'applications de ces molécules. Sur le plan fondamental, l'enjeu était aussi d'améliorer la compréhension des relations entre structure et spécificité des glucane-saccharases. Pour atteindre nos objectifs, nous avons utilisé une stratégie d'ingénierie combinatoire de la dextrane-saccharase DSR-S de Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, qui catalyse la synthèse d’un dextrane formé à 95 % de liaisons alpha (1→6) et 5 % alpha (1→3). Le travail a tout d'abord consisté à développer une méthode de criblage multi-étapes et à haut-débit, pour isoler et trier les variants de spécificités de liaisons variées. La stratégie comprend une première étape de sélection in vivo sur milieu solide suivie d’un criblage par RMN 1D 1H automatisé au format microplaque. Il s'agit de la première méthode de criblage à haut-débit de la spécificité de liaison des transglucosidases et glycosyltransferases. Cette stratégie a ensuite été appliquée au criblage de deux banques de variants de la DSR-S, totalisant plus de 36 000 clones obtenus par mutagénèse de saturation et recombinaison simultanée de 8 résidus du domaine catalytique. Au total, 82 mutants capables de synthétiser entre 2 et 8 fois plus de liaisons alpha (1→3) par rapport à l’enzyme parentale ont été isolés. La caractérisation des propriétés catalytiques de sept mutants représentatifs de la diversité de spécificité générée a permis d’identifier un nouveau motif peptidique 460DYVHT464 impliqué dans la spécificité de DSR-S. Enfin, la caractérisation de la structure et des propriétés rhéologiques et mécaniques des dextranes synthétisés par ces 7 mutants a mis en évidence les différences de taille et de conformation de ces macromolécules en solution et révélé l’aptitude du polymère synthétisé par le variant H463R/T464V/S512T à former des films bio-sourcés innovants, dont les propriétés mécaniques sont remarquables en comparaison de celles d'autres biopolymères extraits de plantes ou produits par fermentationGlucansucrases are transglucosidases from glycoside hydrolase family 70. From sucrose, these enzymes catalyse the synthesis of alpha -glucans, high molecular weight polymers formed of glucosyl units. Glucansucrases are also able to synthesize oligosaccharides or glucoconjugates by transglucosylation reaction onto various exogenous acceptors. Due to the large specificity, in terms of osidic linkages synthesized [alpha (1→2); alpha (1→3); alpha (1→4) or alpha (1→6)] and their organization within the formed products, these biocatalysts can be used to produce carbohydrates of interest in food, health and environment fields. The aim of this research work was to generate, by enzyme engineering, new glucansucrases able to synthesize alpha -glucans and gluco-oligosaccharides with novel structures and properties, to enlarge applications of these molecules. At fundamental level, the work was to improve the understanding of the relationships between structure and specificity of glucansucrases. To reach our objectives, we used a combinatorial engineering strategy on the dextransucrase DSR-S of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, which catalyses the synthesis of a dextran formed by 95 % of alpha (1→6) and 5 % alpha (1→3) linkages. The work consisted first in the development of a multi-step high throughput screening methodology to sort out and isolate variants with altered linkage specificities. The strategy includes a first stage of in vivo selection on solid medium followed by an automated 1D 1H NMR-based screening using microplates. To date, this is the first high-throughput screening method for linkage specificity determination of transglucosidases and glycosyltransferases. This strategy was applied to the screening of two DSR-S variants libraries, totalizing more than 36,000 clones obtained by saturation mutagenesis and simultaneous recombination of 8 residues from the catalytic domain. Eighty two mutants able of synthesize 2 to 8 times more alpha (1→3) linkages compared to the parental enzyme were isolated. The characterization of the catalytic properties of 7 representative mutants enabled the identification of a new peptide motif 460DYVHT464, involved in DSR-S specificity. Finally, the characterization of structural, rheological and mechanical properties of dextrans synthetized by these 7 mutants highlighted the differences in size and conformation of these macromolecules in solution and revealed the capacity of the polymer synthesized by H463R/T464V/S512T variant to form biofilms, whose mechanical properties are remarkable in comparison to those of other biopolymers extracted from plants or produced by fermentation

Internal Water Dynamics Control the Transglycosylation/Hydrolysis Balance in the Agarase (AgaD) of Zobellia galactanivorans

International audienc

Correction: A Robust and Efficient Production and Purification Procedure of Recombinant Alzheimers Disease Methionine-Modified Amyloid-β Peptides.

[This corrects the article DOI: 10.1371/journal.pone.0161209.]

A Robust and Efficient Production and Purification Procedure of Recombinant Alzheimers Disease Methionine-Modified Amyloid-β Peptides.

An improved production and purification method for Alzheimer's disease related methionine-modified amyloid-β 1-40 and 1-42 peptides is proposed, taking advantage of the formation of inclusion body in Escherichia coli. A Thioflavin-S assay was set-up to evaluate inclusion body formation during growth and optimize culture conditions for amyloid-β peptides production. A simple and fast purification protocol including first the isolation of the inclusion bodies and second, two cycles of high pH denaturation/ neutralization combined with an ultrafiltration step on 30-kDa cut-off membrane was established. Special attention was paid to purity monitoring based on a rational combination of UV spectrophotometry and SDS-PAGE analyses at the various stages of the process. It revealed that this chromatography-free protocol affords good yield of high quality peptides in term of purity. The resulting peptides were fully characterized and are appropriate models for highly reproducible in vitro aggregation studies

Combinatorial engineering of dextransucrase specificity

We used combinatorial engineering to investigate the relationships between structure and linkage specificity of the dextransucrase DSR-S from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, and to generate variants with altered specificity. Sequence and structural analysis of glycoside-hydrolase family 70 enzymes led to eight amino acids (D306, F353, N404, W440, D460, H463, T464 and S512) being targeted, randomized by saturation mutagenesis and simultaneously recombined. Screening of two libraries totaling 3.6.10(4) clones allowed the isolation of a toolbox comprising 81 variants which synthesize high molecular weight alpha-glucans with different proportions of alpha(1 -> 3) linkages ranging from 3 to 20 %. Mutant sequence analysis, biochemical characterization and molecular modelling studies revealed the previously unknown role of peptide (DYVHT464)-D-460 in DSR-S linkage specificity. This peptide sequence together with residue S512 contribute to defining +2 subsite topology, which may be critical for the enzyme regiospecificity

NMR-Based Structural Glycomics for High-Throughput Screening of Carbohydrate-Active Enzyme Specificity

International audienceWe report here the development of a straightforward, sensitive, and quantitative NMR-based method for high-throughput characterization of carbohydrate structure and screening of carbohydrate active enzyme (CAZyme) specificity. Automated assays starting from gene library expression to carbohydrate structure determination directly from crude reaction media have been established and successfully used to screen a library of 4032 CAZymes obtained by combinatorial engineering, at a rate of 480 enzyme variants per day. This allowed one to accurately discriminate 303 enzyme variants with altered specificity. The results demonstrate the potential of high-throughput NMR technology in novel biocatalysts in glycomics, to mine artificial and natural enzyme diversity fo

Properties of new dextrans designed using dextransucrase mutants

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