Role of methylotrophy during symbiosis between Methylobacterium nodulans and Crotalaria podocarpa

Some rare leguminous plants of the genus Crotalaria are specifically nodulated by the methylotrophic bacterium Methylobacterium nodulans. In this study, the expression and role of bacterial methylotrophy were investigated during symbiosis between M. nodulans, strain ORS 2060(T), and its host legume, Crotalaria podocarpa. Using lacZ fusion to the mxaF gene, we showed that the methylotroph genes are expressed in the root nodules, suggesting methylotrophic activity during symbiosis. In addition, loss of the bacterial methylotrophic function significantly affected plant development. Indeed, inoculation of M. nodulans nonmethylotroph mutants in C. podocarpa decreased the total root nodule number per plant up to 60%, decreased the whole-plant nitrogen fixation capacity up to 42%, and reduced the total dry plant biomass up to 46% compared with the wild-type strain. In contrast, inoculation of the legume C. podocarpa with nonmethylotrophic mutants complemented with functional mxa genes restored the symbiotic wild phenotype. These results demonstrate the key role of methylotrophy during symbiosis between M. nodulans and C. podocarpa

Approche pluridisciplinaire de la Symbiose Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa

The Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa interaction is an original symbiosis. First, major metabolic modifications in the nodule will take place due to bacterial methylotrophic property located at the nodule apex: a significant apical degradation was observed after cell wall digestion, with free methanol emission, directly available for the bacterium. The bacteroid (size and form unusually large) provides the useful energy to nitrogenase activity, allowing the plant to accumulate organic compounds inside infected cells in amyloplasts. In addition, the bacterial methylotrophic property contributes to plant biomass benefit (40% higher when compared to non methylotrophic mutants). However, any Crotalaria species take advantage in terms of nitrogen fixation to be combined with either M. nodulans or Bradyrhizobium sp., the latter bacterial genus being commonly associated with Crotalaria sp. The feature of the symbiosis is also original due to molecular interactions: M. nodulans nod genes are insensitive to Bradyrhizobium flavonoid inducers (isoflavones) but are inducible by flavanones and flavones. The phylogenetic analysis of identified nod genes shows that M. nodulans belongs to the same branch as Methylobacterium sp. 4-46 and Burkholderia tuberum STM678, isolated from others species belonging to Crotalarieae tribe. A new Nod factor was identified as a bacterial signal as follows MnV(C18:1, S). Thus, if the specific M. nodulans – plant interaction was only reported for three Crotalaria species, the bacterium capacity to form pseudonodules with different Crotalaria points out the major key role of other chemical key signals during the infection process and suggests various molecular mechanisms supporting the symbiotic specificity.La symbiose Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa est une symbiose originale. En effet, la méthylotrophie, propriété remarquable de la bactérie, s'exprime à l'apex du nodule et modifie localement le métabolisme : une dégradation apicale marquée des tissus est observée suite à une digestion des parois végétales, libérant du méthanol directement utilisable par la bactérie. Grâce à ce métabolisme, le bactéroïde -de taille et de forme inhabituellement grandes- fournirait l'énergie nécessaire à l'activité de la nitrogénase, et permettrait à la plante d'accumuler des réserves carbonées sous forme d'amyloplastes dans les cellules infectées. Cette propriété méthylotrophique bactérienne apporte également à la plante-hôte un gain de biomasse (>40 % par rapport aux mutants non méthylotrophes). En revanche, à l'échelle de l'espèce, la crotalaire n'est pas avantagée, en termes de fixation d'azote, à s'associer avec M. nodulans ou avec Bradyrhizobium sp., autre genre bactérien décrit en symbiose avec ces plantes. L'originalité de cette association symbiotique se situe également au niveau du dialogue moléculaire : les gènes nod de M. nodulans sont insensibles aux isoflavones, flavonoïdes inducteurs des Bradyrhizobium, mais sont induits par les flavanones et les flavones. L'analyse phylogénétique des gènes nod révèle que M. nodulans forme une branche particulière avec Methylobacterium sp. 4-46 et Burkholderia tuberum STM678, isolées de nodules de Légumineuses appartenant à la tribu des Crotalariae. Au niveau du signal bactérien, une structure unique de facteur Nod a été caractérisée chez M. nodulans ORS2060T : MnV(C18:1, S). Enfin, si la symbiose fonctionnelle M. nodulans/ Crotalaria a été identifiée seulement chez trois espèces de ce genre, la capacité du partenaire bactérien à former des pseudonodules avec d'autres Crotalaria laisse entrevoir un rôle clé de plusieurs composés pendant le processus d'infection suggérant différents mécanismes moléculaires impliqués dans la spécificité d'hôte

The Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa symbiosis: a classic process for an original model

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Approche plutidisciplinaire de la symbiose Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa

La symbiose Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa est une symbiose originale. En effet, la méthylotrophie, propriété remarquable de la bactérie, s'exprime à l'apex du nodule et modifie localement le métabolisme : une dégradation apicale marquée des tissus est observée suite à une digestion des parois végétales, libérant du méthanol directement utilisable par la bactérie. Grâce à ce métabolisme, le bactéroïde -de taille et de forme inhabituellement grandes- fournirait l'énergie nécessaire à l'activité de la nitrogénase, et permettrait à la plante d'accumuler des réserves carbonées sous forme d'amyloplastes dans les cellules infectées. Cette propriété méthylotrophique bactérienne apporte également à la plante-hôte un gain de biomasse (>40 % par rapport aux mutants non méthylotrophes). En revanche, à l'échelle de l'espèce, la crotalaire n'est pas avantagée, en termes de fixation d'azote, à s'associer avec M. nodulans ou avec Bradyrhizobium sp., autre genre bactérien décrit en symbiose avec ces plantes. L'originalité de cette association symbiotique se situe également au niveau du dialogue moléculaire : les gènes nod de M. nodulans sont insensibles aux isoflavones, flavonoïdes inducteurs des Bradyrhizobium, mais sont induits par les flavanones et les flavones. L'analyse phylogénétique des gènes nod révèle que M. nodulans forme une branche particulière avec Methylobacterium sp. 4-46 et Burkholderia tuberum STM678, isolées de nodules de Légumineuses appartenant à la tribu des Crotalariae. Au niveau du signal bactérien, une structure unique de facteur Nod a été caractérisée chez M. nodulans ORS2060T : MnV(C18:1, S). Enfin, si la symbiose fonctionnelle M. nodulans/ Crotalaria a été identifiée seulement chez trois espèces de ce genre, la capacité du partenaire bactérien à former des pseudonodules avec d'autres Crotalaria laisse entrevoir un rôle clé de plusieurs composés pendant le processus d'infection suggérant différents mécanismes moléculaires impliqués dans la spécificité d'hôteThe Methylobacterium nodulans / Crotalaria podocarpa interaction is an original symbiosis. First, major metabolic modifications in the nodule will take place due to bacterial methylotrophic property located at the nodule apex: a significant apical degradation was observed after cell wall digestion, with free methanol emission, directly available for the bacterium. The bacteroid (size and form unusually large) provides the useful energy to nitrogenase activity, allowing the plant to accumulate organic compounds inside infected cells in amyloplasts. In addition, the bacterial methylotrophic property contributes to plant biomass benefit (40% higher when compared to non methylotrophic mutants). However, any Crotalaria species take advantage in terms of nitrogen fixation to be combined with either M. nodulans or Bradyrhizobium sp., the latter bacterial genus being commonly associated with Crotalaria sp. The feature of the symbiosis is also original due to molecular interactions: M. nodulans nod genes are insensitive to Bradyrhizobium flavonoid inducers (isoflavones) but are inducible by flavanones and flavones. The phylogenetic analysis of identified nod genes shows that M. nodulans belongs to the same branch as Methylobacterium sp. 4-46 and Burkholderia tuberum STM678, isolated from others species belonging to Crotalarieae tribe. A new Nod factor was identified as a bacterial signal as follows MnV(C18:1, S). Thus, if the specific M. nodulans plant interaction was only reported for three Crotalaria species, the bacterium capacity to form pseudonodules with different Crotalaria points out the major key role of other chemical key signals during the infection process and suggests various molecular mechanisms supporting the symbiotic specificityMONTPELLIER-BU Sciences (341722106) / SudocSudocFranceF

Symbiotic properties of Methylobacterium nodulans ORS 2060(T) : A classic process for an atypical symbiont

Some legume species of the Crotalaria genus are specifically nodulated by methylotrophic bacteria belonging to the Methylobacterium nodulans species. The feature of this symbiotic bacterium is its ability to oxidize methanol, a property based on the presence of a methanol dehydrogenase enzyme. Despite a good knowledge of this property and its implication in symbiosis, the molecular dialogue between M. nodulans and crotalaria podocarpa leading to symbiosis is largely unknown, except the presence of a nodA nodulation gene in the genome of M. nodulans ORS 2060. To investigate if M. nodulans ORS 2060 produces Nod factors, molecules considered as the major bacteria-to-plant signals essential for the establishment of rhizobia-legume symbiosis, we identified and sequenced a nodDABCUIJHQ cluster from a genomic library of ORS 2060. Phylogenetic analyses of nod genes revealed that M. nodulans ORS 2060 form a branch together with Burkholderia tuberum STM678 and a strain of Methylobacterium sp. (4-46) isolated from Lotononis, and distinct from all the other rhizobia. To analyse the regulation of ORS 2060 nod genes, we constructed a nodA-LacZ promoter fusion to monitor the nod gene expression with various flavonoids. The flavone apigenin was found to be the strongest inducer of nod gene expression in M. nodulans ORS 2060. This latter flavonoid was used to induce ORS 2060, and Nod factors were purified by high-performance liquid chromatography (HPLC) and further characterized by mass spectrometry. One major Nod factor structure was identified as a pentamer of chitin substituted by C18:1 or C16:0 acyl chains on the non-reducing end and 6-O-sulphated on the other end, suggesting a classic symbiotic dialogue between M. nodulans and C podocarpa