Estudio de la estabilidad de aptámeros generados frente a la proteína 4E-BP1

El control de la síntesis de proteínas juega un papel importante en el crecimiento y proliferación celular. En la mayoría de los organismos eucariotas se lleva a cabo una traducción dependiente de cap en la cual el factor eucariótico de iniciación (eIF) 4E juega un papel muy importante. La actividad de este factor está regulada por la proteína 4E-BP1 (proteína de unión a eIF4E), entre otras, cuya fosforilación permite la liberación del factor y su participación en la traducción. La sobreexpresión del factor eIF4E produce irregularidades en el ciclo celular relacionadas con el cáncer, enfermedad que produce 8.2 millones de muertes anuales en el mundo. La actividad reguladora de la proteína 4E-BP1 la convierte en una posible diana terapéutica, por lo que en el laboratorio se seleccionaron tres aptámeros frente a dicha proteína a través del método SELEX. Los aptámeros se conocen como 1R, 1F y 20F y poseen estructuras secundarias complejas y con posibilidad de formación de G-cuádruplex, lo que les confiere una alta estabilidad. Por ello en el presente trabajo se ha ampliado la caracterización estructural y funcional de estos aptámeros mediante parámetros como susceptibilidad a nucleasas, IC50, niveles intracelulares, efecto sobre la síntesis de proteínas y constante de disociación. Los resultados posicionan a los aptámeros 1R y 20F como los más estables y los principales candidatos como potenciales herramientas terapéuticas. Sin embargo, es necesario realizar nuevos experimentos funcionales así como estudiar la especificidad de los aptámeros frente a otras proteínas y otros aspectos importantes para su aplicación clínic

An Aptamer against MNK1 for Non-Small Cell Lung Cancer Treatment

Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide. Its late diagnosis and consequently poor survival make necessary the search for new therapeutic targets. The mitogen-activated protein kinase (MAPK)-interacting kinase 1 (MNK1) is overexpressed in lung cancer and correlates with poor overall survival in non-small cell lung cancer (NSCLC) patients. The previously identified and optimized aptamer from our laboratory against MNK1, apMNKQ2, showed promising results as an antitumor drug in breast cancer in vitro and in vivo. Thus, the present study shows the antitumor potential of apMNKQ2 in another type of cancer where MNK1 plays a significant role, such as NSCLC. The effect of apMNKQ2 in lung cancer was studied with viability, toxicity, clonogenic, migration, invasion, and in vivo efficacy assays. Our results show that apMNKQ2 arrests the cell cycle and reduces viability, colony formation, migration, invasion, and epithelial-mesenchymal transition (EMT) processes in NSCLC cells. In addition, apMNKQ2 reduces tumor growth in an A549-cell line NSCLC xenograft model. In summary, targeting MNK1 with a specific aptamer may provide an innovative strategy for lung cancer treatment.R.C.-M. was supported for predoctoral contracts (PEJD 2016-BMD-2145 and 2018-BMD-9201) from the Community of Madrid and grant RTC2019-07227-1. M.E.M. and V.M.G. are researchers from FIBio-HRC supported by Consejeria de Sanidad (CAM). This work was supported by grants RTC2019-07227-1 and PID2019-105417RB-I00, funded by MCIN/AEI/10.13039/501100011033 (Ministry of Economy and Competitiveness, Spain)

Deeping in the Role of the MAP-Kinases Interacting Kinases (MNKs) in Cancer

The mitogen-activated protein kinase (MAPK)-interacting kinases (MNKs) are involved in oncogenic transformation and can promote metastasis and tumor progression. In human cells, there are four MNKs isoforms (MNK1a/b and MNK2a/b), derived from two genes by alternative splicing. These kinases play an important role controlling the expression of specific proteins involved in cell cycle, cell survival and cell motility via eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) regulation, but also through other substrates such as heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1, polypyrimidine tract-binding protein-associated splicing factor and Sprouty 2. In this review, we provide an overview of the role of MNK in human cancers, describing the studies conducted to date to elucidate the mechanism involved in the action of MNKs, as well as the development of MNK inhibitors in different hematological cancers and solid tumors

Efecto antitumoral de un aptámero frente a la proteína quinasa MNK1 B en cáncer de mama

El cáncer de mama es una enfermedad que afecta con mayor incidencia a las mujeres, siendo el quinto tipo de tumor con mayor mortalidad en la población mundial (Braet al. 2018). Aunque cada vez existen más opciones terapéuticas, hay dos aspectos que aún siguen sin resolverse. Por un lado, el hecho de que aparezca resistencia a muchos tratamientos y, por el otro, que aún no se hayan identificado dianas terapéuticas para los tumores de tipo Triple negativo. En nuestro laboratorio se seleccionaron y caracterizaron aptámeros contra MNK1b (Garcia-Recio et al. 2016), una proteína quinasa que está sobeexpresada en diferentes tipos de tumores, y en concreto en los tumores de mama Triple negativo (Pinto-Diez et al. 2018). De los aptámeros originalmente seleccionados frente a MNK1b, el aptámero apMNK2F fue capaz de inhibir la proliferación, la migración y la formación de colonias en células de cáncer de mama MDA-MB-231 (Garcia-Recio et al. 2016(Garcia-Recio et al. 2016). En este trabajo nos hemos propuesto generar y caracterizar estructural y funcionalmente un aptámero optimizado que pueda llegar a ser utilizado como un fármaco antitumoral en el futuro. En este trabajo se describe el aptámero apMNKQ2, que es resultado de la optimización de un aptámero previamente generado frente a la proteína quinasa MNK1b, la cual juega un papel relevante en la ruta de las MAP quinasas, frente a la que no existen fármacos en la clínica, y que está implicada en mecanismos de resistencia a fármacos frente a la vía PI3K/AKT/mTOR. Además, se muestra que apMNKQ2, que tiene un reducido tamaño (29 nt) y es capaz de formar una estructura G-quadruplex formada por cinco planos de guaninas, presenta características moleculares y estructurales que le confieren elevadas estabilidad y especificidad, manteniendo la actividad del aptámero parental. Por otra parte, hemos querido estudiar el efecto funcional del aptámero in vitro e in vivo. Así, demostramos que apMNKQ2 es capaz de inhibir procesos moleculares característicos de las células tumorales, tanto en lo que se refiere a su actividad tumorogénica (proliferación, inhibición de apoptosis y formación de colonias) como metastásicas (migración e invasión) en células tumorales de mama. Por último, se muestra que estudios preliminares en un modelo murino de cáncer de mama, el aptámero apMNKQ2 ha demostrado una eficacia significativa reduciendo el volumen de los tumores de los ratones, lo que permite concluir que apMNKQ2 puede ser un potencial fármaco para terapias sustitutivas y/o combinadas, tanto en el tratamiento del cáncer de mama como en otros tumores donde se ha demostrado la implicación de MNK1

Characterization of MNK1b DNA Aptamers That Inhibit Proliferation in MDA-MB231 Breast Cancer Cells

Elevated expression levels of eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) promote cancer development and progression. MAP kinase interacting kinases (MNKs) modulate the function of eIF4E through the phosphorylation that is necessary for oncogenic transformation. Therefore, pharmacologic MNK inhibitors may provide a nontoxic and effective anticancer strategy. MNK1b is a truncated isoform of MNK1a that is active in the absence of stimuli. Using in vitro selection, high-affinity DNA aptamers to MNK1b were selected from a library of ssDNA. Selection was monitored using the enzyme-linked oligonucleotide assay (ELONA), and the selected aptamer population was cloned and sequenced. Four groups of aptamers were identified, and the affinities of one representative for rMNK1b were determined using ELONA and quantitative polymerase chain reaction. Two aptamers, named apMNK2F and apMNK3R, had a lower Kd in the nmol/l range. The secondary structure of the selected aptamers was predicted using mFold, and the QGRS Mapper indicated the presence of potential G-quadruplex structures in both aptamers. The selected aptamers were highly specific against MNK1, showing higher affinity to MNK1b than to MNK1a. Interestingly, both aptamers were able to produce significant translation inhibition and prevent tumor cell proliferation and migration and colony formation in breast cancer cells. These results indicate that MNK1 aptamers have an attractive therapeutic potential

Potential Therapeutic Use of Aptamers against HAT1 in Lung Cancer

Lung cancer is one of the leading causes of death worldwide and the most common of all cancer types. Histone acetyltransferase 1 (HAT1) has attracted increasing interest as a potential therapeutic target due to its involvement in multiple pathologies, including cancer. Aptamers are single-stranded RNA or DNA molecules whose three-dimensional structure allows them to bind to a target molecule with high specificity and affinity, thus making them exceptional candidates for use as diagnostic or therapeutic tools. In this work, aptamers against HAT1 were obtained, subsequently characterized, and optimized, showing high affinity and specificity for HAT1 and the ability to inhibit acetyltransferase activity in vitro. Of those tested, the apHAT610 aptamer reduced cell viability, induced apoptosis and cell cycle arrest, and inhibited colony formation in lung cancer cell lines. All these results indicate that the apHAT610 aptamer is a potential drug for the treatment of lung cancer

Potential Therapeutic Use of Aptamers against HAT1 in Lung Cancer

Lung cancer is one of the leading causes of death worldwide and the most common of all cancer types. Histone acetyltransferase 1 (HAT1) has attracted increasing interest as a potential therapeutic target due to its involvement in multiple pathologies, including cancer. Aptamers are single-stranded RNA or DNA molecules whose three-dimensional structure allows them to bind to a target molecule with high specificity and affinity, thus making them exceptional candidates for use as diagnostic or therapeutic tools. In this work, aptamers against HAT1 were obtained, subsequently characterized, and optimized, showing high affinity and specificity for HAT1 and the ability to inhibit acetyltransferase activity in vitro. Of those tested, the apHAT610 aptamer reduced cell viability, induced apoptosis and cell cycle arrest, and inhibited colony formation in lung cancer cell lines. All these results indicate that the apHAT610 aptamer is a potential drug for the treatment of lung cancer