Axanthism in Phyllomedusa iheringii (Anura: Phyllomedusidae) in the southern limit of distribution

La coloración atípica en los anfibios es un fenómeno raro que a veces ocurre en la naturaleza. Se encontró un espécimen de tono azul brillante de Phuyllomedusa ihereingii durante una sesión de encuestas en Maldonado, Uruguay. Esta coloración responde a una mutación genética que altera la producción de pigmentos amarillos y que podría estar indicando cierto grado de aislamiento local en las poblaciones del entorno. A pesar de tratarse de un registro aislado, es de destacar que la mutación se detectó en el límite sur de la distribución mundial de la especie

Overproduction of a Trichoderma harzianum chitinase and analysis of its biotechnological potential to produce chitooligosaccharides

Trabajo presentado en la 7ª ed. del congreso internacional "FEMS" organizado por la Sociedad Española de Microbiología y la Federación Europea de Sociedades Microbiológicas en el Centro de Convenciones Feria Valencia (Valencia, España) durante los días 9 al 13 de julio de 2017.BACKGROUNDS: Chitooligosaccharides (COS) are β-(1,4)-linked oligomers of N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) and glucosamine (GlcN) formed by chemical or enzymatic hydrolysis of chitosan or chitin. The growing biotechnological interest of COS in fields such as food or health increases the demand of the producing enzymes as well as their characterization and functional improvement. | OBJETIVES: Express a chitinase of 42 kDa from Trichoderma harzianum in a heterologous system, obtain protein levels compatible with its crystallization for the future protein structural resolution and evaluate the ability of the recombinant protein to produce COS. | METHODS: The chitinase gene cDNA from T. harzianum was expressed in Pichia pastoris using a restriction-free cloning strategy, production of heterologous protein was analysed and escalated up to a 5 L fermenter level. Recombinant protein was purified and some crystals were obtained which allows undertake the protein structural resolution. Synthesis of oligosaccharides from different substrates were evaluated and optimized using the recombinant enzyme. HPAEC-PAD on a Dionex ICS3000 system and Mass Spectrometry were used in the reaction studies and product characterization. | CONCLUSIONS: A chitinase of 42 kDa from T. harzianum was overexpressed in P. pastoris, the recombinant protein was purified, characterized and crystallized for the protein structural resolution. Production of COS mediated by this enzyme was evaluated and some of the molecules formed were characterized.N

Producción sostenible de nuevos glicoconjugados con potenciales propiedades prebióticas mediante la β-fructofuranosidasa Ffase de Schwanniomyces occidentalis

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de Lectura: 10-10-2023Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 10-04-2025La β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) «Ffase» de la levadura no convencional Schwanniomyces occidentalis cataliza en presencia de sacarosa reacciones de transfructosilación que suponen la formación de fructooligosacáridos (FOS) con propiedades prebióticas, siendo una de las máximas productoras conocidas de 6-kestosa. En el presente trabajo, se investigó esta habilidad transferente para la síntesis eficaz de nuevos fructoconjugados de posible interés biotecnológico. Para ello, se caracterizó la enzima Ffase en virtud de un modelo cinético no clásico y se examinó su especificidad aceptora sobre diferentes sustratos alternativos al azúcar común (el donador fructosílico), incluyendo mono-, di-y oligosacaráridos, así como glicósidos y polialcoholes. Un total de diecinuevecompuestos, en su mayoría de este último grupo, pudieron ser fructosilados con variadadinámica y eficiencia. Las incubaciones que contenían glucosa, glicerol, eritritol o manitolpermitieron generar, en condiciones máximas, 17 g/L de blastosa, 62 g/L de 1/2-O-β-D-fructofuranosil-glicerol, 35 g/L de 1/4-O-β-D-fructofuranosil-D-eritritol, y 44 g/L de 1-O-β-D-fructofuranosil-D-manitol, respectivamente. El análisis cristalográfico de los complejos deFfase inactivada con fructosil-eritritol y sacarosa contribuyó a revelar las bases molecularesde la interacción existente entre los aceptores positivos y el centro activo de estaglicosidasa. Dos pares de aminoácidos, Gln-176/Arg-178 y Gln-228/Asn-254, destacaron porsu importancia en el reconocimiento de los sustratos y la modulación de la regioselectividad.Paralelamente, se pusieron en práctica diversas estrategias para intentar optimizar ysimplificar el proceso de obtención de productos fructosilados por parte de Ffase, a saber, laevaluación de versiones enzimáticas mutadas, la catálisis por células enteras y el empleo debiodisolventes. La sustitución de secuencia N254T posibilitó conseguir el doble de cantidadde blastosa, un 31 % más de fructosil-eritritol e, incluso, trazas de 1/4-O-β-D-levanbiosil-D-eritritol. También, en menor medida, otras variantes, Q228E y S196L, conllevaron unincremento del 9 % y el 17 % en la cuantía final de, correspondientemente, fructosil-manitoly fructosil-glicerol. De manera sobresaliente, los cultivos microbianos de Schw. occidentalisoSaccharomyces cerevisiae que expresaban Ffase, ya sea nativa o mutada, pudieronsintetizar cantidades inéditas de FOS tras ser suplementados con concentracionessaturantes de sustrato directamente en el propio matraz sin necesidad de purificarpreviamente la enzima. De hecho, en este sistema, la modificación S196L logró duplicar elrendimiento final de 6-kestosa y blastosa, así como originar pequeñas proporciones de 6,6-nistosa. Por su parte, la actividad sintética de Ffase resultó asimismo compatible con oncecosolventes químicos distintos, en particular, líquidos iónicos y derivados de biomasa, todosellos ecológicos, inmiscibles en agua y extraíbles con facilidad. Un par de éteres de glicerolfluorosos, de referencia GCL17 y GCL20, mejoraron la tasa de transfructosilación de estaglicosidasa un 34 % y 40 %, respectivamente. Este efecto se correlacionó con cambiosfluorimétricos que sugerían un mayor mantenimiento de la integridad estructural proteínic

Novel synthesis of fructo-conjugated compounds catalysed by ß-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis

Trabajo presentado en la 29ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 27 de febrero de 2015.The relevance of enzyme-catalysed processes in many areas of industry is gradually increasing year after year, especially for synthesizing pharmaceutical drugs and food ingredients. In this context, non-conventional yeasts are playing an import role in the discovery of alternative enzymes with new abilities and potential applications. Recently, the ascomycetous Schwanniomyces occidentalis has gained a great biotechnological interest because of, among other things, its outstanding extracellular glycosyl-hydrolytic enzyme system. β-Fructofuranosidase or invertase (EC 3.2.1.26) from this yeast is reported not only to be able to efficiently cleave β-(2→1) linkage of sucrose to split off fructose (hydrolytic activity), but also to transfer a fructosyl moiety from a donor sucrose molecule into another acceptor one (transfructosylating activity) through the formation of a new glycosidic bond. This enzyme is capable to synthesize 6-kestose from sucrose, with one of the highest selectivity and yields yet described for this trisaccharide using an enzymatic system, as well as 1-kestose in a 3:1 ratio. Interestingly, the study in detail of this peculiar capacity on the basis of analytical techniques has shown that this enzyme can fructosylate certain substrates different from sucrose as well, including, monosaccharides, disaccharides, and sugar alcohols. Thus, resulting in the enzymatic generation of fructo-conjugated compounds of a kind that may be difficult to obtain by classical chemical synthesis.N

Yeast cultures expressing the Ffase from Schwanniomyces occidentalis, a simple system to produce the potential prebiotic sugar 6-kestose

11 pags., 6 figs., 1 tab.The β-fructofuranosidase Ffase from the yeast Schwanniomyces occidentalis produces potential prebiotic fructooligosaccharides with health-promoting properties, making it of biotechnological interest. Ffase is one of the highest and more selective known producers of 6-kestose by transfructosylation of sucrose. In this work, production of 6-kestose was simplified by directly using cultures of S. occidentalis and Saccharomyces cerevisiae expressing both the wild-type enzyme and a mutated Ffase variant including the Ser196Leu substitution (Ffase-Leu196). Best results were obtained using yeast cultures supplemented with sucrose and expressing the Ffase-Leu196, which after only 4 h produced ~ 116 g/L of 6-kestose, twice the amount obtained with the corresponding purified enzyme. 6-Kestose represented ~ 70% of the products synthesized. In addition, a small amount of 1-kestose and the neofructoligosaccharides neokestose and blastose were also produced. The Ser196Leu substitution skewed production of 6-kestose and neofructooligosaccharides resulting in an increase of ~ 2.2- and 1.5-fold, respectively, without affecting production of 1-kestose. Supplementing yeast cultures with glucose clearly showed that blastose originates from direct fructosylation of glucose, a property that has not been described for other similar proteins from yeasts. Modeling neokestose and blastose into the Ffase-active site revealed the molecular basis explaining the peculiar specificity of this enzyme.This work was supported by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness: BIO2016-76601-C3-2/-3, and by institutional grants from Fundación Ramón Areces and Banco de Santander to the Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. Besides, funding has been received from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation program [Blue Growth: Unlocking the potential of Seas and Oceans] under grant agreement No [634486; INMARE]. D.P. was supported by the Spanish Ministry of Education’s University Personnel Training Plan ref. FPU014/01004

Síntesis de nuevos compuestos fructoconjugados mediante el empleo de la ß-fructofuranosidasa de Schwanniomyces occidentalis

Trabajo presentado en la 2ª ed. del congreso nacional "Jornadas Españolas de Biocatálisis" (JEB) organizado por la Sociedad Española de Biotecnología en el Campus de El Cristo de la Universidad de Oviedo (Asturias, España) durante los días 25 al 26 de junio de 2018.Los procesos sintéticos mediados por enzimas están adquiriendo hoy en día cada vez mayor importancia en la industria, especialmente para la obtención de moléculas altamente específicas de manera poco costosa y respetuosa con el medio ambiente. En este contexto, las levaduras no convencionales ofrecen una verdadera oportunidad para descubrir nuevas enzimas alternativas que permitan desempeñar acciones catalíticas inéditas con múltiples posibles aplicaciones. Recientemente, el ascomiceto Schwanniomyces occidentalis ha suscitado interés biotecnológico por disponer de un amplio sistema glicosilhidrolítico extracelular de elevada operatividad y robustez. Su enzima β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) no sólo se ha mostrado capaz de escindir eficientemente enlaces fructosídicos β-(2→1) ó β-(2→6) presentes en diversos sacáridos o heterósidos (actividad hidrolítica); sino que también tiene el potencial para transfructosilar con distinto grado de regioselectividad ciertos sustratos aceptores a partir de donadores no activados como la sacarosa (actividad transferente). El estudio en detalle de esta habilidad catalítica ha permitido conocer con mayor exactitud la especificidad aceptora de esta enzima sobre una gran cantidad de azúcares y glicitoles. Las reacciones con dos de los glicitoles que mostraron mayor rendimiento, eritritol y manitol, fueron escaladas y los productos obtenidos purificados y caracterizados. Asimismo, se han puesto en práctica distintas estrategias para aumentar la tasa de transfructosilación de los aceptores positivos, como son la optimización de las concentraciones de sustrato, la variación de los tiempos de reacción y el empleo de biodisolventes, tanto derivados de biomasa como líquidos iónicos. Todo ello está generando como resultado la formación biocatalítica de nuevos compuestos fructoconjugados de posible interés bioactivo que serían de lo contrario difíciles de obtener por síntesis química clásica.N

New insights into the molecular mechanism behind mannitol and erythritol fructosylation by β-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis

12 pags., 5 figs., 2 tabs.The β-fructofuranosidase from Schwanniomyces occidentalis (Ffase) is a useful biotechnological tool for the fructosylation of different acceptors to produce fructooligosaccharides (FOS) and fructo-conjugates. In this work, the structural determinants of Ffase involved in the transfructosylating reaction of the alditols mannitol and erythritol have been studied in detail. Complexes with fructosyl-erythritol or sucrose were analyzed by crystallography and the effect of mutational changes in positions Gln-176, Gln-228, and Asn-254 studied to explore their role in modulating this biocatalytic process. Interestingly, N254T variant enhanced the wild-type protein production of fructosyl-erythritol and FOS by ∼ 30% and 48%, respectively. Moreover, it produced neokestose, which represented ∼ 27% of total FOS, and yielded 31.8 g l blastose by using glucose as exclusive fructosyl-acceptor. Noteworthy, N254D and Q176E replacements turned the specificity of Ffase transferase activity towards the synthesis of the fructosylated polyols at the expense of FOS production, but without increasing the total reaction efficiency. The results presented here highlight the relevance of the pair Gln-228/Asn-254 for Ffase donor-sucrose binding and opens new windows of opportunity for optimizing the generation of fructosyl-derivatives by this enzyme enhancing its biotechnological applicability.This work was supported by the Spanish Ministries of Economy and Competitiveness (BIO2016- 76601-C3-1/-2/-3) and of Science and Innovation (PID2019-105838RB-C3-1/-2/-3) as well as Fundación Ramón Areces (XIX Call of Research Grants in Life and Materials Sciences). We appreciate Fundación Ramón Areces for providing an institutional grant to the Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. D. Piedrabuena was a recipient of a doctoral fellowship from the Spanish Ministry of Education, Culture, and Sports (FPU014/01004). We thank the staf members of the Synchrotron Radiation Source at Barcelona (ALBA, Spain) for providing access and technical assistance at BL13-XALOC beamline

Fructosilación de polioles con una ß-fructofuranosidasa de Schwanniomyces occidentalis, una aproximación a las bases moleculares de la especificidad enzimática

Trabajo presentado en la 33ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 18 de marzo de 2019.En la actualidad, la síntesis enzimática de productos específicos con un valor añadido está adquiriendo un mayor peso en la industria debido a su bajo coste y respeto hacia el medio ambiente. Por ello, la búsqueda de nuevas enzimas en levaduras no convencionales permite alternativas a los métodos químicos convencionales. La levadura Schwanniomyces occidentalis expresa una β-fructofuranosidasa (Ffase, EC 3.2.1.26) que, además de hidrolizar sacarosa, es capaz de transferir moléculas de fructosa al disacárido y generar pequeños fructooligosacáridos (FOS) con enlaces β-(2→6) y β-(2→1), básicamente 6-kestosa y 1-kestosa, respectivamente. La enzima puede fructosilar también distintos monosácaridos y compuestos hidroxilados, entre ellos polioles como el manitol y eritritol. La estructura 3D de la Ffase fue ya previamente caracterizada, se obtuvieron distintos complejos proteína-sustratos/productos y los determinantes estructurales implicados en la capacidad hidrolasa y transferasa de la proteína fueron también determinados. En este trabajo, se han analizado las bases moleculares de la selectividad del proceso de producción de fructosil-eritritol/manitol de Ffase. Para ello, se purificaron los correspondientes polioles fructosilados y se cristalizaron en complejo con la variante inactiva de la proteína Ffase-D50A, previamente expresada en Saccharomyces cerevisiae. El análisis cristalográfico de los complejos reveló que los residuos Q176 y Q228 de la proteína tenían un papel fundamental en el reconocimiento de manitol, y la posición N254 en el del eritritol. Se realizaron reacciones de fructosilación de polioles utilizando variantes mutantes de la Ffase en las que las posiciones referenciadas habían sido sustituidas por diferentes aminoácidos y se evaluaron los productos obtenidos utilizando técnicas cromatográficas (HPLC-ELSD). Los resultados verificaron el papel de estos residuos en el proceso de producción de polioles fructosilados, y en uno de los mutantes utilizados se logró mejorar la producción de fructosil-eritritol en un 20%.N

Empleo de células de Saccharomyces cerevisiae productoras de variantes mejoradas de la ß-fructofuranosidasa de Schwanniomyces occidentalis para la síntesis de fructooligosacáridos prebióticos

Trabajo presentado en la ed. anual 2017 del congreso nacional BIOTEC organizado por la Sociedad Española de Biotecnología en el Campus La Merced de la Universidad de Murcia durante los días 18 a 21 de junio de 2017.Los prebióticos ocupan un espacio importante en el mercado alimentario debido a su creciente demanda por parte de los consumidores. Este hecho supone un reto para la industria alimentaria, obligada a la búsqueda de métodos de producción más económicos y sostenibles. Los fructooligosacáridos (FOS) son el grupo más amplio de prebióticos con carácter demostrado. La enzima β-fructofuranosidasa del ascomiceto Schwanniomyces occidentalis (Sw-Ffase) es capaz de transferir unidades de fructosa a una molécula de sacarosa formando enlaces β-(2,6) y, en menor medida, β-(2,1), dando lugar a trisacáridos con propiedades prebióticas. Además, es capaz de transferir moléculas de fructosa a distintos tipos de azúcares y alditoles. La proteína ya se expresó en Saccharomyces cerevisiae (Sc-Ffase) y se resolvió su estructura 3D. La capacidad transferasa de la enzima se mejoró empleando técnicas de mutación racional y evolución molecular dirigida. En este trabajo proponemos un método de síntesis de FOS mediante el uso de células de S. cerevisiae que expresan dos variantes mejoradas de esta enzima: S196L, obtenida por mutación puntual, y 11H8 que incluye las mutaciones Q78L, S196L, I203V y F523V, obtenida tras 4 ciclos de evolución molecular dirigida. Los azúcares producidos en la reacción de transfructosilación se valoraron mediante HPLC y se determinó el rendimiento de la reacción tras emplear las células reiteradamente. La 6-kestosa fue el trisacárido mayoritario de la muestra, seguido de 1-kestosa y neokestosa. También se valoraron los tetrasacáridos, nistosa y neonistosa, procedentes de la transfructosilación de la 1-kestosa y neokestosa, respectivamente. En todos los casos, la concentración total de FOS obtenidos en las reacciones se incrementó sustancialmente con respecto a los valores conseguidos previamente con las variantes enzimáticas purificadas, lo que supone la simplificación y abaratamiento de la producción de este tipo de azúcares prebióticos.N

Transformación de azúcares alcohólicos en potenciales prebióticos empleando la ß-fructofuranosidasa de Schwanniomyces occidentalis

Trabajo presentado en la 1ª ed. del congreso nacional "Jornadas Españolas de Biocatálisis" organizado por la Sociedad Española de Biotecnología en el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC) en Madrid (España) del 2 al 3 de julio del año 2015.Los azúcares reducidos en su función carbonílica –denominados polialcoholes ó azúcares alcohólicos– son compuestos no cariogénicos que se emplean como edulcorantes en productos de uso tan cotidiano como los chicles o las pastas dentífricas. Además, tienen aplicaciones en preparados para diabéticos y personas con sobrepeso, así como excipientes en formulaciones farmacéuticas. La mayoría de ellos se absorben en el intestino delgado y pasan al torrente sanguíneo. Sin embargo, si están glicosilados (p. ej. en el caso del lactitol) dicha absorción se ve dificultada, y los derivados llegan al intestino grueso donde pueden actuar como prebióticos. Una de las estrategias más empleadas en glicosilación enzimática es la fructosilación. Para la introducción de grupos fructosilo suelen utilizarse enzimas como las β-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26). En particular, la procedente de la levadura Schwanniomyces occidentalis se caracteriza por transferir un residuo de fructosa al 6-OH de otra fructosa que a su vez forma parte de una molécula de sacarosa, generando 6-kestosa como producto principal. Las propiedades prebióticas de este trisacárido son comparables a las de los fructooligosacáridos (FOS) de la serie inulina. En este trabajo hemos explotado la actividad de transfructosilación de la β-fructofuranosidasa de Schw. occidentalis utilizando como aceptores varios azúcares polialcohólicos. Las reacciones se llevaron a cabo a 50°C con sacarosa (200 g/L) como donador de grupos fructosilo y 400-600 g/L del aceptor, en acetato sódico 0.2 M pH 5.5, y se analizaron mediante cromatografía HPLC con detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD). Las reacciones con dos de los polialcoholes que dieron mayor rendimiento (eritritol y manitol) fueron escaladas, y los productos obtenidos se purificaron mediante HPLC preparativa para posteriormente ser caracterizados mediante espectrometría de masas y RMN bidimensional.N