Sexual pheromone modulates the frequency of cytosolic Ca2+ bursts in Saccharomyces cerevisiae

Transient and highly regulated elevations of cytosolic Ca2+ control a variety of cellular processes. Bulk measurements using radioactive Ca2+ and the luminescent sensor aequorin have shown that in response to pheromone, budding yeast cells experience a rise of cytosolic Ca2+ that is mediated by two import systems composed by the Mid1-Cch1-Ecm7 protein complex, and the Fig 1 protein. Although this response has been largely studied, there is no report on Ca2+ dynamics at the single cell level. Here, using protein calcium indicators we show that both vegetative and pheromone-treated yeast cells exhibit discrete and asynchronous Ca2+ bursts. Most bursts reach maximal amplitude in 1-10 secs, span between 7 and 30 secs and decay fitting a single exponential model. In vegetative cells bursts are scarce but preferentially occur when cells are transitioning G1 and S phase. Upon pheromone presence Ca2+ burst occurrence increases dramatically, persisting during cell growth polarization. Pheromone concentration modulates burst frequency in a mechanism that depends on Mid1, Fig 1 and a third, still unidentified, import system. We also show that the calcineurin-responsive transcription factor Crz1 experiences nuclear localization bursts during the pheromone response.Fil: Carbo, Natalia. Instituto Pasteur de Montevideo; UruguayFil: Tarkowski, Nahuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas. Universidad Nacional de San Martín. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; ArgentinaFil: Perez Ipiña, Emiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Aguilar, Pablo Sebastián. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

Oscillatory surface rheotaxis of swimming E. coli bacteria

Bacterial contamination of biological conducts, catheters or water resources is a major threat to public health and can be amplified by the ability of bacteria to swim upstream. The mechanisms of this rheotaxis, the reorientation with respect to flow gradients, often in complex and confined environments, are still poorly understood. Here, we follow individual E. coli bacteria swimming at surfaces under shear flow with two complementary experimental assays, based on 3D Lagrangian tracking and fluorescent flagellar labelling and we develop a theoretical model for their rheotactic motion. Three transitions are identified with increasing shear rate: Above a first critical shear rate, bacteria shift to swimming upstream. After a second threshold, we report the discovery of an oscillatory rheotaxis. Beyond a third transition, we further observe coexistence of rheotaxis along the positive and negative vorticity directions. A full theoretical analysis explains these regimes and predicts the corresponding critical shear rates. The predicted transitions as well as the oscillation dynamics are in good agreement with experimental observations. Our results shed new light on bacterial transport and reveal new strategies for contamination prevention.Comment: 12 pages, 5 figure

Análisis y modelado de experimentos de fluorescencia. Aplicación a señales de calcio

En este trabajo se estudian, desde un punto de vista teórico, distintas técnicas ópticas que permiten observar in vivo procesos que ocurren en células y embriones. Todas ellas involucran la obtención de registros o imágenes de fluorescencia. Uno de los objetivos del trabajo es determinar cómo analizar los datos experimentales para extraer información cuantitativa sobre parámetros biofísicos relevantes para los fenómenos observados. En particular, se analiza cómo hacerlo cuando las moléculas observadas difunden e interactúan (reaccionan) con otras especies. En los distintos casos analizados las fluctuaciones de los registros o imágenes cumplen un rol fundamental ya que se usan para extraer información. En base al conocimiento construido a partir del estudio de las fluctuaciones en experimentos de fluorescencia, en el presente trabajo se avanza también sobre otro aspecto relevante para los procesos de señalización biológica como es el tiempo que le lleva a un mecanismo celular endógeno “sensar” la concentración de un ligando con un dado nivel de error. En la primera parte de la Tesis se hace foco en el estudio de la técnica conocida como Espectroscopía por Correlación de Fluorescencia (FCS, por su nombre en inglés). En los experimentos de FCS se obtienen registros de fluorescencia en un pequeño volumen a partir de los cuales se calcula la función de autocorrelación (ACF) de las fluctuaciones de la fluorescencia. Ajustando la ACF es posible extraer los tiempos de correlación que la caracterizan y los pesos con que entran dichos tiempos. Usando un modelo dinámico de los procesos que subyacen a las observaciones es posible pasar de los parámetros de ajuste a parámetros biofísicos. En particular, a partir de los tiempos de correlación pueden estimarse las tasas de transporte de las moléculas marcadas y, a partir de los pesos, puede obtenerse información sobre la concentración de las moléculas observadas. En el Capítulo 2 se estudia de qué modo, para un sistema de moléculas marcadas que reaccionan y difunden, los tiempos de correlación dependen de los parámetros del sistema y de los del experimento. Se muestra, en particular, cómo variando el volumen de observación los tiempos característicos pasan de estar determinados exclusivamente por los coeficientes de difusión libre de las especies involucradas a depender de coeficientes efectivos que son función de las tasas de reacción. En el Capítulo 3 se estudia la variación de la ACF dependiendo de si las moléculas marcadas interactúan con sitios móviles o inmóviles. Se observa que en el caso de sitios inmóviles hay un tiempo de correlación cuyo peso se anula lo que tiene implicancias directas sobre la estimación de concentraciones a partir de los experimentos. En este Capítulo se estudia también con qué precisión es posible estimar concentraciones dependiendo de la longitud de los registros analizados. En el Capítulo 4 se estudia la precisión de los mecanismos de “lectura” endógenos que involucran la ligadura de moléculas “efectoras” a sitios en la célula y la posterior generación de una respuesta que depende de la concentración “leída”. Se presentan, en particular, expresiones que permiten estimar el error en la concentración sensada como función del tiempo de observación y los tiempos característicos del sistema. Uno de los mayores aportes de esta parte del trabajo radica en que, a diferencia de estudios anteriores, las expresiones describen el decaimiento del error para todo el rango de tiempos de observación, no sólo en el límite asintótico. Por otro lado, incorpora una correción que tiene en cuenta la no linealidad del sistema que es relevante para tiempos tempranos cuando se estudia el comportamiento de sitios de ligadura únicos. En el trabajo se muestra cómo esta corrección “no lineal” permite interpretar la reducción en las fluctuaciones observada en experimentos realizados en embriones de la mosca Drosophila melanogaster cuando se comparan las asociadas a la producción instantánea de mRNA con las de la proteína correspondiente acumulada a lo largo del tiempo. A partir de la descripción de las fluctuaciones tempranas se presenta también en este Capítulo una estimación de la distribución de tiempos de espera entre eventos de ligadura consecutivos. La distribución obtenida permite interpretar observaciones experimentales de la actividad de enzimas a nivel de molécula única sin recurrir a modelos que suponen que la molécula fluctúa entre un sinnúmero de estados conformacionales distintos. La observación de fenómenos in vivo mediante microscopía de fluorescencia es en gran parte factible debido a que pueden manipularse los organismos en estudio para que expresen algunas proteínas de interés con una cola fluorescente. Esto permite, por ejemplo, estudiar las propiedades espacio-temporales de gradientes de proteínas involucrados en morfogénesis. Un caso analizado con gran detalle es el del desarrollo embrionaria temprano de la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, en particular, el del gradiente de la proteína Bicoid (Bcd) a lo largo del eje antero-posterior. En muchos trabajos se interpretan las observaciones experimentales en el marco de un modelo (SDD) en el que el Bcd es sintetizado en un extremo del embrión desde donde difunde a lo largo de éste a la vez que se degrada. El modelo SDD no logra explicar cuantitativamente las características observadas del gradiente. En el Capítulo 5 se analiza de qué modo varía la información que puede extraerse de las imágenes al tener en cuenta que Bcd no sólo difunde sino que también se liga a sitios internos y que la fluorescencia observada no distingue entre Bcd libre y Bcd ligado. Se introduce para tal fin una extensión del modelo SDD al que llamamos SDID ya que incluye la interacción con sitios de ligadura con el que se estudia tanto la dinámica espacio-temporal de la concentración de Bcd como su habilidad para actuar como factor de transcripción. El modelo logra reproducir las observaciones experimentales con parámetros biofísicos razonables y abre la puerta a una reinterpretación de la relación existente entre Bcd y la proteína Hunchback para cuya producción el Bcd es factor de transcripción. Finalmente, en el Capítulo 6 se analiza la validez y limitaciones de un modelo que describe las fluctuaciones de fluorescencia en imágenes donde se observa la distribución de Ca2+ intracelular utilizando fluoróforos que cambian su intensidad al ligar a este ión (single-wavelength Ca2+ dyes). El modelo es la base de un método que permite comparar cuantitativamente entre sí experimentos de señales de Ca2+ realizados en distintas condiciones experimentales y que ayuda, por otro lado, a identificar parámetros experimentales óptimos para cada “set-up”. El análisis detallado presentado en este Capítulo muestra que el modelo reproduce correctamente las fluctuaciones observadas aunque no siempre para un conjunto unívoco de parámetros.Fil: Perez Ipiña, Emiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

From free to effective diffusion coefficients in fluorescence correlation spectroscopy experiments

Diffusion is one of the main transport processes that occur inside cells determining the spatial and time distribution of relevant action molecules. In most cases these molecules not only diffuse but also interact with others as they get transported. When these interactions occur faster than diffusion the resulting transport can be characterized by “effective diffusion coefficients” that depend on both the reaction rates and the “free” diffusion coefficients. Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) gives information on effective rather than free diffusion coefficients under this condition. In the present paper we investigate what coefficients can be drawn from FCS experiments for a wide range of values of the ratio of reaction to diffusion time scales, using different fitting functions. We find that the effective coefficients can be inferred with relatively small errors even when the condition of fast reactions does not exactly hold. Since the diffusion time scale depends on the size of the observation volume and the reaction time scale depends on concentrations, we also discuss how by changing either one or the other property one can switch between the two limits and extract more information on the system under study.Fil: Perez Ipiña, Emiliano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentin

The effect of reactions on the formation and readout of the gradient of Bicoid

During early development, the establishment of gradients of transcriptional factors determinesthe patterning of cell fates. The case of Bicoid (Bcd) in Drosophila melanogaster embryos is welldocumented and studied. There are still controversies as to whether SDD models in which Bcd isSynthesized at one end, then Diffuses and is Degraded can explain the gradient formation withinthe timescale observed experimentally. The Bcd gradient is observed in embryos that express aBicoid-eGFP fusion protein (Bcd-GFP) which cannot differentiate if Bcd is freely diffusing orbound to immobile sites. In this work we analyze an SDID model that includes the Interaction ofBcd with binding sites. We simulate numerically the resulting full reaction?diffusion system in acylindrical domain using previously determined biophysical parameters and a simplified version ofthe Bcd source. In this way we obtain solutions that depend on the spatial location approximately asobserved experimentally and that reach such dependence at a time that is also compatible with theexperimental observations. Analyzing the differences between the free and bound Bcd distributionswe observe that the latter spans over a longer lengthscale. We conclude that deriving the lengthscalefrom the distribution of Bcd-GFP can lead to an overestimation of the gradient lengthscale and ofthe Hill coefficient that relates the concentrations of Bcd and of the protein, Hunchback, whoseproduction is regulated by Bcd.Fil: Perez Ipiña, Emiliano. Universite Nice; Francia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

How long should a system be observed to obtain reliable concentration estimates from the measurement of fluctuations?

The interior of cells is a highly fluctuating environment. Fluctuations set limits to the accuracy with which endogenous processes can occur. The physical principles that rule these limits also affect the experimental quantification of biophysical parameters in situ. The characterization of fluctuations, on the other hand, provides a way to quantify biophysical parameters. But as with any random process, enough data has to be collected to achieve a reliable quantitative description. In this article we study the accuracy with which intracellular concentrations can be estimated using fluorescence correlation spectroscopy. We show that, when the observed molecules interact with immobile species or experience other restrictions to their movement, the hypotheses commonly used to estimate concentrations are no longer valid. The interactions with immobile sites reduce the fluorescence variance by a finite amount. The time that is necessary to obtain an accurate concentration estimate, on the other hand, is hundreds of times larger than the slowest correlation time and is much larger when the sites move slowly than when they are immobile. Our analysis is applicable to other related techniques and it also sheds light on the way in which effector concentrations are read by target molecules in cells.Fil: Perez Ipiña, Emiliano. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentin

Fluctuations, correlations and the estimation of concentrations inside cells

Information transmission in cells occurs quite accurately even when concentration changes are "read" by individual binding sites. In this paper we study ligand number and site occupancy fluctuations when ligands diffuse and react going beyond the analyses that focus on their asymptotic decay. In this way we show that, for immobile binding sites, fluctuations in the number of bound molecules decay on a relatively fast scale before the asymptotic behavior kicks in. This result can explain the observed co-existence of highly fluctuating instantaneous transcriptional activities with accumulated mRNA concentrations that have relatively small noise levels. We also show that the initial stages of the decay in the bound molecule number fluctuations have one or two characteristic timescales depending on the concentration of free molecules. This transition can explain the changes in enzyme activity observed at the single molecule level.Fil: Perez Ipiña, Emiliano. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; ArgentinaFil: Ponce Dawson, Silvina Martha. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Física; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Física de Buenos Aires. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Física de Buenos Aires; Argentin

Fluorescence fluctuations and equivalence classes of Ca²⁺ imaging experiments.

Ca²⁺ release into the cytosol through inositol 1,4,5-trisphosphate receptors (IP₃Rs) plays a relevant role in numerous physiological processes. IP₃R-mediated Ca²⁺ signals involve Ca²⁺-induced Ca²⁺-release (CICR) whereby Ca²⁺ release through one open IP₃R induces the opening of other channels. IP₃Rs are apparently organized in clusters. The signals can remain localized (i.e., Ca²⁺ puffs) if CICR is limited to one cluster or become waves that propagate between clusters. Ca²⁺ puffs are the building blocks of Ca²⁺ waves. Thus, there is great interest in determining puff properties, especially in view of the current controversy on the spatial distribution of activatable IP₃Rs. Ca²⁺ puffs have been observed in intact cells with optical techniques proving that they are intrinsically Ca²⁺ dyes, slow exogenous buffers (e.g., EGTA) to disrupt inter-cluster CICR and UV-photolyzable caged IP3. Single-wavelength dyes increase their fluorescence upon calcium binding producing images that are strongly dependent on their kinetic, transport and photophysical properties. Determining the artifacts that the imaging setting introduces is particularly relevant when trying to analyze the smallest Ca²⁺ signals. In this paper we introduce a method to estimate the expected signal-to-noise ratio of Ca²⁺ imaging experiments that use single-wavelength dyes. The method is based on the Number and rightness technique. It involves the performance of a series of experiments and their subsequent analysis in terms of a fluorescence fluctuation model with which the model parameters are quantified. Using the model, the expected signal-to-noise ratio is then computed. Equivalence classes between different experimental conditions that produce images with similar signal-to-noise ratios can then be established. The method may also be used to estimate the smallest signals that can reliably be observed with each setting

Statistics of pathogenic bacteria in the search of host cells

International audienceAbstract A crucial phase in the infection process, which remains poorly understood, is the localization of suitable host cells by bacteria. It is often assumed that chemotaxis plays a key role during this phase. Here, we report a quantitative study on how Salmonella Typhimurium search for T84 human colonic epithelial cells. Combining time-lapse microscopy and mathematical modeling, we show that bacteria can be described as chiral active particles with strong active speed fluctuations, which are of biological, as opposed to thermal, origin. We observe that there exists a giant range of inter-individual variability of the bacterial exploring capacity. Furthermore, we find Salmonella Typhimurium does not exhibit biased motion towards the cells and show that the search time statistics is consistent with a random search strategy. Our results indicate that in vitro localization of host cells, and also cell infection, are random processes, not involving chemotaxis, that strongly depend on bacterial motility parameters