Un método electroforético mejorado destinado al análisis de caseína bovina

An alternative electrophoretic method that improves the separation, identification and relative quantification of bovine milk casein fractions and casein hydrolysates was developed. The method is based in the Tricine-SDS-PAGE technique while the relative quantification of milk proteins has been achieved by digital densitometry. The advantages of this procedure for milk proteins and milk protein hydrolysates\nare that bands are well separated and can be readily detected and quantified. In the new method, ás1 -, ás2-, â- and ê -casein and low molecular weight peptides (casein degradation products with high electrophoretic mobility) that cannot be usually detected by other electrophoretic systems are visualized as sharp bands.Ha sido desarrollado un método electroforético alternativo que mejora la separación, identificación y cuantificación relativa de caseína bovina y de hidrolizados de caseína. El método se basa en la técnica de Tricina-SDS-PAGE, en tanto que la\ncuantificación relativa de las proteínas lácteas fue realizada por densitometría digital. Una de las ventajas de este\nprocedimiento para proteínas de leche y de sus hidrolizados es que las bandas se encuentran bien separadas y pueden ser fácilmente detectadas y cuantificadas. En el nuevo método, as1-, as2 -, ß - y ê -caseína y los péptidos de bajo peso molecular (productos de degradación de la caseína con elevada movilidad electroforética), que no pueden ser habitualmente detectados por otros sistemas electroforéticos, son visualizados como bandas nítidas.Ha sido desarrollado un método electroforético alternativo que mejora la separación, identificación y cuantificación relativa de caseína bovina y de hidrolizados de caseína. El método se basa en la técnica de Tricina-SDS-PAGE, en tanto que la\ncuantificación relativa de las proteínas lácteas fue realizada por densitometría digital. Una de las ventajas de este\nprocedimiento para proteínas de leche y de sus hidrolizados es que las bandas se encuentran bien separadas y pueden ser fácilmente detectadas y cuantificadas. En el nuevo método, as1-, as2 -, ß - y ê -caseína y los péptidos de bajo peso molecular (productos de degradación de la caseína con elevada movilidad electroforética), que nopueden ser habitualmente detectados por otros sistemas electroforéticos, son visualizados como bandas nítidas

Obtención y valoración de carotenoides florales de plantas que crecen en la provincia de Buenos Aires : Separación de fracciones de diferente grado de oxidación y su relacion con la capacidad pigmentante

Se ha estudiado el contenido en carotenoides totales, carotenos y pigmentos monohidroxilados y dihidroxilados de un grupo de especies que crecen en estado silvestre o que se cultivan en la provincia de Buenos Aires. Independientemente del efectivo aporte al conocimiento fitoquímico de nuestra Flora, los objetivos del trabajo han estado dirigidos a la búsqueda de especies con un contenido destacado en carotenoides hidroxilados, que son los que poseen mayor poder pigmentante al ser incorporados a la dieta de aves de corral.Tesis digitalizada en SEDICI gracias a la Biblioteca Central de la Facultad de Ciencias Exactas (UNLP).Facultad de Ciencias Exacta

Estudio preliminar de "Macrodontina", una nueva cisteinilproteinasa aislada de frutos de Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae)

From inmature fruits of Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms, known as ihvirá in the northeast of Argentina, has been isolated and partially characterized a sulfhydril-protease highly active between pH 7 and 10. The acetonic precipitates are quite stable at temperatures below 45ºC and not affected by freezing or liophylization. Anionic exchange chromatography (DEAE-Sepharose Fast Flow) affords two active fractions, both well resolved by gel filtration (Sephadex G-75). The electrophoretic pattern (SDS-PAGE) of the acetonic precipitate shows six protein fractions, between 14 and 67 kDa, but the zymogram reveals the presente of three active fractions, of about 27,30, arid 54 kDa.De los frutos semimaduros del ihvirá (Pseudananas macrodontes (Morr.) Harms (Bromeliaceae) se ha logrado aislar y caracterizar parcialmente una proteasa sulfhidrílica ( macrodontina ) con actividad destacada entre pH 7 y 10. Las preparaciones parcialmente purificadas (precipitados acetónicos) son relativamente estables a temperaturas inferiores a 45ºC y no se alteran por congelamiento o liofilización. Una ulterior purificación por cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-Sepharose Fast Flow) permite detectar dos fracciones activas, que son bien resueltas por cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-75). Por electroforesis (SDS-PAGE) del precipitado acetónico se detectan seis fracciones proteicas (entre 14 y 67 kDa), pero el zimograma revela que sólo tres de ellas tienen actividad caseinolítica, de pesos moleculares de alrededor de 27,30 y 54 kDa

Caracterización parcial de una proteinasa coagulante de la leche aislada del alcaucil (Cynara scolymus L., Asteraceae)

The presence of proteinases in Cynara scolyrnus L. ( artichoke ) has been investigated by determining the proteolytic and milk clotting activities of crude extracts of different parts of the inflorescence in various stages of development, as well as of leaves and roots. Although all the preparations showed a certain extent of proteolytic activity, only those of adult leaves, pappus, and immature and mature flowers were able to clot milk. The extract of the upper (violet) part of mature flowers exhibited optimum activity at acid pH values (90% of maximum activity at pH 3.5 - 5.0) which was strongly inhibited by pepstatine A, suggesting the presence of aspartic proteinases. This extract had a low thermal stability at temperatures above 45ºC, which could be a useful property in cheese making process, as it could be quickly inactivated by moderate heating.Se ha estudiado la presencia de proteinasas en el alcaucil (Cynara scolymus L.) midiendo la actividad proteolítica y la capacidad coagulante de la leche de preparaciones crudas de diferentes partes de la inflorescencia en distintos estadios de desarrollo, así como en raíces y hojas. Si bien se detecta actividad proteolitica en todas las preparaciones, sólo las de hojas adultas, de papus y de flores inmaduras y maduras son capaces de coagular la leche. El extracto de la parte superior (violeta) de las flores maduras exhibe un perfil de pH que es óptimo en la zona ácida (90% de máxima actividad entre pH 3,5 y 5,0), pero la actividad es fuertemente inhibida por pepstatina A, lo que sugeriría la presencia de una o más proteinasas aspárticas. La estabilidad térmica del extracto es baja a temperaturas superiores a 45ºC, circunstancia que puede resultar de utilidad en la producción de quesos, ya que la enzima puede ser inactivada a temperaturas moderadas

Proteasas de Bromeliaceae: V. Separación y purificación de sulfhidril - proteasas presentes en frutos de Bromelia balaasae Mez

Almost ripe fruits of Bromelia balansae Mez (Bromeliaceae) were blade homogeneized within cold (-20 O C ) acetone, providing a crude preparation that could be partialiy solubllized in phosphate buffer (pH 6,4) containing EDTA and cysteine 5 mM. Solutions hydrolize casein (maximum a c t ~ t ypH 6.25-8.5O), the activity being enhanced by addition of cysteine. The crude enzyme was purified by molecular sieve chromatography (Sephadex G-75, Superfme) and ion exchange chromatography (DEAE- and CM-Sepharose). Three proteolitically active fractions were thus obtainedLa trituración de frutos semimaduros de Bromelia balansae Mez (Bromeliaceae) en presencia de acetona fría (-20 OC) permite obtener una preparación enzimática cruda, que al ser tratada con buffer fosfatos de pH 6,4 conteniendo EDTA y cisteína 5 mM produce una solución con actividad proteolítica apreciable y con máxima acción hidrolítica sobre caseína dentro de un rango de pH entre 6,25 y 8,50. Esta solución enzimática cruda se purificó por cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-75 Superfuio) y de intercambio iónico (DEAE- y CM-Sepharosa), con lo que se obtuvieron tres fracciones proteolíticamente activas.El presente trabajo recibió el apoyo de la CIC y fue presentado en el X Congreso\nFarmacéutico Argentino (San Luis, 1988)

Extraction and partial characterization of a coagulant preparation from Silybum marianum flowers: its action on bovine caseinate

An outstanding parameter in cheese making is the type of coagulant, which greatly influences the characteristics of the final products. Proteolysis is the most important set of biochemical changes during ripening of most cheeses, and is carried out, in different magnitude, by proteolytic agents originated in milk, rennet (or rennet substitute), and starter and non-starter micro-organisms (Silva & Malcata, 2000). The demand for alternative sources of milk coagulants, to replace the expensive and limited natural rennet supplies, has increased (Esteves et al. 2001). All commercial enzymes employed as milk coagulant are aspartic proteinases, which are most active at acidic pH and preferentially cleave peptide bonds between residues with hydrophobic side-chains (Silva & Malcata, 1999). Because of the presence of aspartic proteinases, aqueous crude extracts from flowers of Cynara cardunculus (Verı´ssimo et al. 1995, 1996), Cynara humilis, and/or Cynara scolymus are traditionally employed in the Iberian Peninsula as vegetable rennet for cheesemaking (Reis et al. 2000). Milk clotting activity was also proved in flowers of Centaurea calcitrapa and Onopordum turcicum (Tamer, 1993; Domingos et al. 1998). All these species are included within the Asteraceae family and furthermore in the same tribe : Cardueae Cass.=Cynareae Less. (Ariza Espinar & Delucchi, 1998). When a potential rennet substitute is studied, it is particularly important to evaluate adequately the degradation patterns of the caseins because of their effects on yield, consistency, and flavour of the final cheese (Fox, 1989). It is important to guarantee a well-balanced breakdown of curd proteins (caseins) in order to avoid formation of undesired attributes in cheese such as low viscosity and high bitterness (Visser, 1993). One of the most frequently used methods to monitor proteolytic processes on caseins is urea-polyacrylamide gel electrophoresis. On the other hand, tricine-SDS polyacrylamide gel electrophoresis improves the separation, identification and quantification of casein hydrolysates because it allows the visualization of large and small peptides (Pardo & Natalucci, 2001), with the additional advantage of allowing the estimation of molecular masses. Both methods are then suitable to characterize the performance of vegetable rennet in different ways. This preliminary study had the following objectives: the partial characterization of (i) the aspartic proteolytic activity present in flowers of Silybum marianum (L.) Gaertn. (Asteraceae); and (ii) the hydrolytic profile of bovine caseins.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale

Proteasas presentes en el látex de frutos de Maclura pomifera (Raf.) Schneid. (Moraceae)

Latex obtained by superficial incisions of Machra pomifera fruits, received on cold neutral phosphate buffer and centrifuged to remove gummy material, affords a crude extract with higher proteolylic activity between pH 8.75 and 10.6 and a notably thermal stability that can be advantageously kept as lyophyhed powder. Acetone precipitation followed by ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose CL-6B and CM-Sepharose CL-6B) allows the purification of three active fractions.El látex que se obtiene por incisiones superficiales de frutos de Maclura pomifera, recogido sobre buffer fosfatos 0,l M (pH 7) y centrifugado a 16.000 g para eliminar gomas y otros componentes insolubles, produce un extracto crudo con máxima actividad proteolitica entre pH 8,75 y 10,60 y con excelente estabilidad dad térmica, pudiendo conservarse adecuadamente por liofilización. Por precipitación acetónica y cromatografía de intercambio aniónico (DEAE-Sepharase CL- 6B) y catiónico (CM-Sepharose CL-6B) se consiguen purificar tres fracciones activas

Proteasas de bromeliaceae: I. Estudio preliminar de la fracción proteolíticamente activa presente en frutos de Bromelia laciniosa Mart.

Proteolitically active preparations obtained from matute fruits of Brornelia Iaciniosa Mart. were analyzed by molecular sieve chromatography (Sephadex G-75, Superhe). Best resolution and higher activity are achieved by direct trituration of fruits with cold acetone. Proteolytic capacity is notably diminished in case of unripe fruits.Preparaciones proteolíticamente activas obtenidas a partir de frutos maduros de Bromelia laciniosa Mart fueron anaíizadas por cromatografía de exdusión molecular (Sephadex G75, superfme). El procedimiento de triturar los frutos con acetona fría es el que permite obtener la mejor resolución y los valores más altos de actividad enzirnática. La capacidad proteolitica es considerablemente menor en el caso de frutos verdes

Proteasas de Bromeliaceae: V. Separación y purificación de sulfhidril - proteasas presentes en frutos de Bromelia balaasae Mez

Almost mature fruits of Bromelia serra Griseb., blade homogenized (Waring blender) with cold acetone (-20ºC), provide a light, proteolitically active acetone powder (1, 93g%, w/w). Extractives obtained by gentle stirring with phosphate buffer pH 6,4 containing 5 mM cysteine and 5 mM EDTA (protein content 8, 24 g per 100 g of powder) show good thermal stability at moderates temperatures and highest caseinolytic activity at pH 6.0-7.8. Gel- filtration (Sephadex G-75, Superfine) allows to separate one active fraction which is resolved in two new, more pursed fractions through ion-exchange chromatography (DEAE Sephacel and CM Sepharose).Por trituración de frutos semimaduros de Brormlia serra Griseb. (Bromeliaceae) en presencia de acetona fría (-20ºC) se obtiene un polvo acetónico (1, 93g%, p/p) con actividad proteolítica. La extracción del mismo con buffer fosfatos de pH 6, 4 conteniendo EDTA 5 mM y cisteína 5 mM permite preparar una solución de enzima cruda con un contenido proteico de 8, 24 g por 100 g de polvo, dotada de buena estabilidad térmica a temperaturas moderadas y con un máximo de actividad caseinolítica a pH 6,0-7,8. Esta preparación cruda se purifica por cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G-75 Superfine) y la fracción activa se resuelve en dos nuevas fracciones por cromatografía de intercambio iónico (DEAE Sephacel y CM Sepharose)

Purification and Characterization of a New Plant Endopeptidase Isolated from Latex of Asclepias fruticosa L. (Asclepiadaceae)

Asclepias fruticosa L. is a small shrub containing latex with proteolytic activity. The crude extract (latex diluted 1:250 and ultracentrifuged) contained 276 μg of protein/mL and the proteolytic activity reached 1.2 caseinolytic U/mL. This enzyme preparation was very stable even after 2 hours at 45°C, but was quickly inactivated after 5 minutes at 80°C. Chromatographic purification was achieved by FPLC using a cation exchanger (SP-Sepharose FF). Thus, a unique proteolitically active fraction could be isolated, being homogeneous by bidimensional electrophoresis and mass spectrometry (Mr = 23,652). The optimum pH range was achieved at 8.5–10.5. The enzyme activity was completely inhibited by specific cysteine peptidases inhibitors. Isoelectric focusing followed by zymogram showed the enzyme had a pI greater than 9.3. The N-terminus sequence (LPDSVDWREKGVVFPIRNQGK) shows a great deal of similarity to those of the other cysteine endopeptidases isolated from latices of Asclepiadaceae even when a high degree of homology could be observed with other plant cysteine endopeptidases.Centro de Investigación de Proteínas Vegetale