Diagnóstico de enfermedades mitocondriales: Nuevas mutaciones del mtDNA y su caracterización patológica

Las enfermedades mitocondriales son un grupo de patologías generadas por mutaciones en la cadena de transporte mitocondrial que dan lugar a un déficit en la síntesis de energía en forma de ATP. Una de estas alteraciones es la deficiencia del complejo IV mitocondrial o citocromo C oxidasa, que afecta a diversas partes del organismo incluyendo corazón, músculo esquelético o hígado. La paciente estudiada en este trabajo presentaba una nueva mutación (m.7637A>G) en el gen MT-CO2 del mtDNA que codificaba una proteína COX2 disfuncional, lo que daba lugar a una deficiencia del complejo IV del sistema OXPHOS. Para establecer por completo la patogenicidad de la mutación se construyeron cíbridos transmitocondriales fusionando plaquetas de la paciente citada con la línea celular ρ0A549. Utilizando las células generadas y disminuyendo el número de copias del mtDNA mutante por medio de un tratamiento con bromuro de etidio, se analizaron parámetros mitocondriales como el nivel de heteroplasmia y de mtDNA, la actividad y cantidad de complejo IV y el funcionamiento del sistema OXPHOS para caracterizar patológicamente la nueva mutación. A la vista de los resultados, la mutación m.7637A>G puede ser de gran severidad por el mal funcionamiento del complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial

Análisis genético-molecular del síndrome de Pearson

El síndrome de Pearson es una enfermedad rara, producida por deleciones en el ADN mitocondrial. Como la mayoría de las enfermedades mitocondriales, el síndrome de Pearson tiene una afectación multisistémica caracterizada por producir vacuolización de progenitores hematopoyéticos y disfunción del páncreas exocrino. En este trabajo, se presentan dos casos de posible síndrome de Pearson para su diagnóstico genético. El primer caso es un paciente cadáver, del que se tienen muestras de distintos tejidos. El segundo caso es un paciente vivo, del que se tienen muestras de sangre. El diagnóstico se realizó mediante las técnicas de PCR larga, Southern blot y PCR-digestión con enzimas de restricción. En ambos casos se llegó al diagnóstico molecular de síndrome de Pearson por la presencia de deleciones superiores al 75% que concuerdan con la clínica de los pacientes. La deleción que presenta el primer caso es de 6516 pb, no está flanqueada por secuencias de repetición y afecta a varias secuencias de ARNt, y de subunidades de citocromo C oxidasa, ATP sintetasa y NADH deshidrogenasa. Esta deleción no se ha descrito anteriormente

Efecto del genotipo mitocondrial sobre la composición del plasmalema neuronal, la sinaptogenésis y la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (AD) se define como un proceso neurodegenerativo del sistema nervioso central (CNS). Esta patología se caracteriza por la pérdida de memoria, cambios de comportamiento y confusión, dejando a los pacientes completamente inválidos. Este tipo de procesos mentales dependen del correcto funcionamiento de las redes neuronales. En el caso del AD son las neuronas colinérgicas las que se ven afectadas. Las conexiones neuronales vienen dadas por la correcta sinaptogénesis, y para ello necesitan la producción de neuritas, elongaciones de la membrana plásmatica de la propia célula. Los principales compuestos de la membrana celular son los fosfátidos. Este tipo de molécula necesita para su formación la participación del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la enzima dihidroorotato deshidrogenasa (DHODH). La combinación de ambos factores da lugar al nucleósido de pirimidina, uridina, precursor de los fosfátidos. Un fallo en la cadena respiratoria de la mitocondria produciría como consecuencia el de la DHODH y una disminución de los niveles de uridina celulares. Se ha observado en diferentes estudios que la administración de uridina y compuestos relacionados (CDP-colina, CTP, UTP) producían una mejoría en pacientes de AD. El estudio de la inhibición de estos dos factores, el sistema OXPHOS y la DHODH, podría explicar el papel de la mitocondria en la formación de la membrana celular y las conexiones neuronales que se ven dañadas con la AD

Deleciones en el DNA mitocondrial causantes del síndrome de Pearson: modelos celulares y aproximaciones terapéuticas.

Las mitocondrias son el único orgánulo de las células animales que contiene su propio DNA (DNA mitocondrial o mtDNA), una molécula circular de doble cadena que codifica 37 genes que incluyen 22 tRNAs, 2 rRNAs (12S y 16S) y 13 polipéptidos que forman parte de cuatro de los cinco complejos del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS). El resto de las subunidades que lo componen están codificadas a nivel nuclear. El sistema OXPHOS se localiza en la membrana mitocondrial interna y es el responsable de dos procesos metabólicos acoplados: la respiración celular y la síntesis de ATP.Las deleciones grandes y únicas en el mtDNA, que provocan la pérdida de numerosos tRNAs, rRNAs y mRNAs codificantes de los complejos de la cadena respiratoria, suelen conllevar consecuencias patológicas muy graves y diversas. El síndrome de Pearson (PS), principalmente caracterizado por anemia sideroblástica y disfunción del páncreas exocrino, es una de las patologías con esta causa genética. La dinámica de propagación de estas deleciones y el fenotipo patológico que provocan podrían depender de diferentes factores como el tipo de deleción, el porcentaje de heteroplasmia, el fondo genético mitocondrial o nuclear, el estado celular, el tejido afectado o las condiciones de cultivo. En este trabajo, hemos desarrollado diferentes modelos celulares portadores de deleciones únicas en el mtDNA para estudiar la influencia de dichos factores. Todos ellos muestran una alteración significativa de la función OXPHOS y de la ultraestructura mitocondrial, siendo el porcentaje de heteroplasmia uno de los factores más determinantes en el fenotipo patológico observado. Asimismo, hemos observado que la activación de la biogénesis mitocondrial para compensar el déficit provocado por las deleciones es un mecanismo que parece depender del fondo genético de cada línea, así como del tipo celular y su perfil metabólico. Además, nuestros resultados indican que el porcentaje umbral causante de efectos patológicos se sitúa en torno al 70 %, independientemente del tamaño de la deleción. Por otro lado, hemos demostrado que la presencia de una deleción en el mtDNA reduce significativamente la capacidad de diferenciación a distintos linajes celulares frecuentemente afectados en estas patologías. Además, hemos observado que algunos tratamientos que hacen a las células portadoras de deleción más dependientes del sistema OXPHOS o que potencian su actividad, son capaces de reducir el porcentaje de heteroplasmia y mejorar el fenotipo.<br /

Estudio de mutaciones en pacientes con enfermedades genéticas mitocondriales

La enfermedad estudiada en este trabajo es la Neuropatía Óptica de Leber (del inglés Leber Hereditary Optic Neuropathy, o LHON). Esta patología cursa con una ceguera, que se torna crónica en ambos ojos. Se produce por una mutación puntual en el DNA mitocondrial (mtDNA). El 90% de estas mutaciones son las denominadas primarias (m.3460G>A, m.1178G>A y m.14484T>C), que afectan al complejo I mitocondrial. Las mutaciones restantes, en su mayoría afectan también a este complejo mitocondrial. La penetrancia de esta enfermedad es muy variable, ya que puede verse afectada por varios factores como hormonales, dietéticos, así como factores nucleares, que pueden afectar a la expresión de la enfermedad. Gracias a esto puede haber portadores que no sufran la enfermedad. En el presente trabajo se estudiaron las células de un paciente que posee una mutación en el mtDNA, la mutación m.13094T>C descrita en un trabajo anterior como probablemente patológica, afectando a la subunidad NT-ND5 del complejo mitocondrial I. En el estudio mencionado, se analizó la función de los fibroblastos del paciente, portadores de la mutación mitocondrial citada, pero también un fondo genético nuclear concreto que pudiera ser también responsable del fenotipo patológico. Por ello, con el objetivo de verificar que la disfunción celular se debe exclusivamente a la mutación mitocondrial, se construyeron híbridos transmitocondriales mediante la enucleación de fibroblastos del paciente y posterior fusión con una línea ρ0 carente de mtDNA. Tras la obtención y selección de esta línea celular transmitocondrial se procedió a realizar diferentes estudios mitocondriales, que evalúan la función e integridad mitocondrial, como son la medida de síntesis de ATP mitocondrial, número de copias de mtDNA, red mitocondrial, entre otros, para verificar que los efectos celulares son provocados por la mutación del mtDNA. Los resultados obtenidos mostraron en los diferentes ensayos han mostrado que efectivamente la función mitocondrial se encuentra afectada por la presencia de la mutación mitocondrial descrita, y por lo tanto parecen ser la causa del cuadro clínico presentado por el paciente

Patogenicidad de variantes genéticas nucleares con implicación en el metabolismo del RNA mitocondrial

Las enfermedades mitocondriales son un conjunto de desórdenes metabólicos y genéticos en que, sobre todo, se encuentra comprometida la fosforilación oxidativa de las mitocondrias. Además, se caracterizan por ser enfermedades muy heterogéneas desde un punto de vista clínico y genético, influyendo en esto último el hecho de que su etiología puede residir en variantes que ocurran tanto en el mtDNA como en el nDNA. La interpretación de la patogenicidad de una variante genética es un proceso complejo que requiere de la integración de los datos clínicos, análisis bioinformáticos y estudios moleculares. En la presente tesis doctoral se han analizado los fibroblastos de dos pacientes con variantes en genes nucleares que codifican para proteínas mitocondriales: un primer paciente con un cuadro clínico característico de una enfermedad mitocondrial y con las variantes p.A507S (cambio de sentido) y p.K562* (sin sentido) en PNPT1, encontradas en heterocigosis compuesta; un segundo paciente con una clínica que se aleja de la neuromuscular más característica de las enfermedades mitocondriales (presenta, sobre todo, una alteración del metabolismo serotoninérgico) y con la variante de novo p.Q346* (sin sentido) en TEFM, detectada en heterocigosis. PNPT1 codifica para la PNPasa, proteína que actúa en forma de homotrímero y que, junto a la helicasa SUV3, constituye el degradosoma, principal complejo implicado en la degradación de los mtRNA. Los experimentos llevados a cabo en células del paciente con las variantes en este gen han permitido concluir que dichas mutaciones son patológicas y que constituyen la etiología genética de su enfermedad, ya que derivan en un déficit de la PNPasa que provoca, en última instancia, una disfuncionalidad del sistema OXPHOS. Además, se ha obtenido que la sobreexpresión de PNPT1 es perjudicial para los fibroblastos primarios, si bien en los inmortalizados puede ser capaz de revertir el fenotipo patológico, y que una alteración en los niveles transcripcionales o proteicos de la PNPasa deriva en una regulación de dichos niveles de la helicasa SUV3. Finalmente, los resultados obtenidos han motivado la propuesta de un modelo por el que la PNPasa se encuentra localizada en la matriz mitocondrial, pero con la posibilidad de que pueda estar tanto en forma soluble como anclada por su N-terminal a la membrana interna de las mitocondrias. TEFM codifica para la proteína homónima, cuya principal función descrita hasta la fecha es la de elongar la transcripción mitocondrial mediante diversos mecanismos con los que apoya a POLRMT en su función, entre los que destacan el aumento de la procesividad de la RNA polimerasa y una función anti-terminadora de la transcripción en CSBII. Los ensayos realizados en células del paciente con la variante en este gen han llevado a concluir que ésta provoca una alteración de la fosforilación oxidativa y abren las puertas a la implicación de TEFM en los mecanismos que relacionan al sistema OXPHOS con los niveles de la serotonina. Además, se ha obtenido que la sobreexpresión de TEFM es tóxica para los fibroblastos, ya que produce una afectación generalizada de todos los parámetros evaluados. Entre ellos, destaca un descenso drástico de la proteína TFAM, unos primers R-loop de tamaño insuficiente para desempeñar su función en el inicio de la replicación y una gran afectación del sistema OXPHOS. Todos estos resultados, junto a los del propio paciente, especialmente al someter a los modelos celulares de estudio a estrés con EtBr, así como los publicados por otros autores, llevan a establecer que la función de TEFM es más compleja que la descrita hasta el momento y que se encuentra condicionada por sus niveles: actúa como un sensor que regula el metabolismo del mtDNA y mtRNA.<br /

Mutaciones nucleares que afectan al sistema de fosforilación oxidativa

Las mitocondrias son orgánulos dinámicos que albergan rutas metabólicas esenciales para la vida. Entre ellas, la fosforilación oxidativa (OXPHOS) que proporciona la mayor parte de la energía útil a las células del cuerpo. Los defectos en su funcionamiento generan las enfermedades de la cadena respiratoria, difíciles de diagnosticar debido a la gran heterogeneidad clínica que presentan los pacientes. La utilización de las técnicas modernas de secuenciación masiva ha permitido identificar variaciones genéticas en el genoma de muchos pacientes. Esto no siempre lleva a un diagnóstico molecular porque la interpretación de las variaciones en el DNA puede resultar muy compleja. En algunos casos afectan a proteínas cuya función no se conoce o no se relaciona con la ruta biológica afectada.En este trabajo se han estudiado los defectos moleculares causados por mutaciones encontradas en genes nucleares de pacientes diagnosticados con enfermedad mitocondrial, siendo el objetivo principal la obtención de un diagnóstico genético-molecular de estos pacientes. Se han analizado fibroblastos derivados de tres pacientes con mutaciones en los genes POLG, NDUFAF6 y ATAD3C respectivamente.Se describe el caso de una paciente, diagnosticada con enfermedad mitocondrial, con dos mutaciones en heterocigosis compuesta en POLG. El estudio clínico, junto con las diferencias in vitro en la cinética de recuperación del mtDNA de las células de control y de paciente, sugieren que los síntomas de enfermedad mitocondrial fueron precipitados por una infección por Borrelia y, posiblemente, empeoraron por el tratamiento farmacológico. Este estudio demuestra la importancia de diagnósticos genéticos tempranos de los pacientes y la necesidad de considerar los riesgos y beneficios en la selección de tratamientos farmacológicos para pacientes con sospecha de desórdenes mitocondriales.A continuación, se describen tres hermanos diagnosticados con el Síndrome de Leigh con dos mutaciones en heterocigosis compuesta en NDUFAF6, factor esencial para la maduración y actividad del complejo I de la cadena de transporte de electrones. Los ensayos funcionales de complementación genética permitieron obtener la evidencia conclusiva de la patogenicidad en esta familia.Por último, se describe el estudio del primer caso de mutaciones en el gen ATAD3C en un paciente diagnosticado con enfermedad mitocondrial. La asociación de su fenotipo con las mutaciones es un reto, debido a que existe muy poca información sobre ATAD3C en la literatura, podría ser un pseudogén y no hay casos previos descritos. En este trabajo, se ha confirmado que ATAD3C genera una proteína mitocondrial que se localiza en la membrana mitocondrial interna, que es capaz de oligomerizar de la misma manera que ATAD3A, y que puede interaccionar con el complejo que forma ATAD3A regulando su función. Estos hallazgos proporcionan un posible mecanismo por el que mutaciones en ATAD3C puedan llevar a patología en humanos<br /

Toxicogenómica de las enfermedades mitocondriales

La Neuropatía Óptica Hereditaria de Leber (LHON) es una enfermedad que cursa con ceguera crónica y que está causada por mutaciones en el genoma mitocondrial. Se caracteriza por tener una baja penetrancia, de manera que ser portador de mutaciones patológicas como m.3460G>A, en estudio en este trabajo, no es determinante para padecer la enfermedad. Haciendo uso del modelo de cíbridos, y mediante el uso de técnicas de cultivo celular, bioquímicas, genético – moleculares y a nivel proteico se pretende demostrar que existen factores genético – nucleares y ambientales que podrían afectar al lugar de unión del coenzima Q10 en el Complejo Respiratorio I, alterando la capacidad OXPHOS y aumentando la penetrancia y el riesgo a manifestar el fenotipo patológico. La caracterización de dicho lugar de unión permite conocer hasta qué punto los genes nucleares y mitocondriales implicados en su conformación pueden afectar la función mitocondrial. En este sentido, se ha estudiado a fondo el gen nuclear NDUFS7 sin encontrar diferencias apreciables en los modelos utilizados, a falta de caracterizar por completo las proteínas que interaccionan con el coenzima Q10. Por otra parte, los xenobióticos podrían afectar directamente esta interacción interrumpiendo la función OXPHOS. Se demuestra que es así en la caso de la rolliniastatina-1, pues la capacidad respiratoria se ve muy disminuida en los modelos mutantes; y la capacidad energética es afectada en valores muy significativos. Este trabajo confirma que la penetrancia de mutaciones patológicas en el genoma mitocondrial se ve afectada por la exposición a factores ambientales

Generación de modelos celulares para el estudio del efecto fenotípico de la variación genética en el mtDNA.

Además de los 23 pares de cromosomas localizados en el núcleo (nDNA), el genoma humano incluye una multitud de moléculas de DNA localizadas en las mitocondrias y conocidas como DNA mitocondrial (mtDNA). El mtDNA codifica 13 subunidades muy importantes del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y los RNAs necesarios para su expresión. Por su localización y particularidades genéticas, el mtDNA acumula mutaciones mucho más rápidamente que el nDNA. Muchas de estas mutaciones pueden dar lugar a fenotipos de enfermedad muy graves. La construcción de modelos celulares es clave para el estudio de las mutaciones. En este trabajo se ha empleado la línea celular HepG2, por su utilidad en estudios in vitro. Se ha estudiado su diferenciación a hepatocito maduro y se ha tratado de eliminar su mtDNA para construir líneas celulares transmitocondriales

GDF-15 is elevated in children with mitochondrial diseases and is induced by mitochondrial dysfunction

Background We previously described increased levels of growth and differentiation factor 15 (GDF-15) in skeletal muscle and serum of patients with mitochondrial diseases. Here we evaluated GDF-15 as a biomarker for mitochondrial diseases affecting children and compared it to fibroblast-growth factor 21 (FGF-21). To investigate the mechanism of GDF-15 induction in these pathologies we measured its expression and secretion in response to mitochondrial dysfunction. Methods We analysed 59 serum samples from 48 children with mitochondrial disease, 19 samples from children with other neuromuscular diseases and 33 samples from aged-matched healthy children. GDF-15 and FGF-21 circulating levels were determined by ELISA. Results Our results showed that in children with mitochondrial diseases GDF-15 levels were on average increased by 11-fold (mean 4046pg/ml, 1492 SEM) relative to healthy (350, 21) and myopathic (350, 32) controls. The area under the curve for the receiver-operating-characteristic curve for GDF-15 was 0.82 indicating that it has a good discriminatory power. The overall sensitivity and specificity of GDF-15 for a cut-off value of 550pg/mL was 67.8% (54.4%-79.4%) and 92.3% (81.5%-97.9%), respectively. We found that elevated levels of GDF-15 and or FGF-21 correctly identified a larger proportion of patients than elevated lev- els of GDF-15 or FGF-21 alone. GDF-15, as well as FGF-21, mRNA expression and protein secretion, were significantly induced after treatment of myotubes with oligomycin and that levels of expression of both factors significantly correlated. Conclusions Our data indicate that GDF-15 is a valuable serum quantitative biomarker for the diagnosis of mitochondrial diseases in children and that measurement of both GDF-15 and FGF-21 improves the disease detection ability of either factor separately. Finally, we demonstrate for the first time that GDF-15 is produced by skeletal muscle cells in response to mitochon- drial dysfunction and that its levels correlate in vitro with FGF-21 level