Thrombocyta aktiváció során bekövetkező változások biokémiai és sejtbiológiai jellemzés = Biochemical and cell biological changes during platelet activation

Ex vivo mintákon végzett analízisek közül elvégeztük 30 db stent beültett beteg esetében perifáriás vérminták analízisét az alábbi thrombocyta aktivációs markerekre: thrombocyta P-selectin, solubilis P-selectin, CD63 expresszió, heterotipikus aggregátumok aránya, mikropartikula mennyiség. Fenti eredményeket korreláltattuk a betegek előzetes kezelési protokolljával (csak ASA, vagy ASA+clopidogrel). A XIII-as faktorral (F XIII) kapcsolatos vizsgálatok során megállapítást nyert, hogy thrombocyták TRAP aktiválása, az FXIII expresszió fokozódásával jár. Azonban kimutattuk, hogy ez a plazmában lévő FXIII kötődése és nem az intracellluláris FXIII felszíni megjelenése miatt jön létre. Specifikus fibrinogének felhasználásával tisztáztuk az FXIII kötődés biokémiai jellemzőit. A thrombocyta foszfatáz inhibitorokkal végzett kísérletek során PRP-ben bizonyítottuk, hogy az 1 és 2A típusú foszfatázoknak csak együttes gátlása hozza létre a thrombocyta aktiválás során észlelhető hatást. TRAP aktivált mintákon bizonyítottuk, hogy mind az aggregáció, mind a P-selectin expresszió dózisfüggő módon gátlódik calyculin (CLA) hatására. Ugyanakkor nem aktivált mintákon azt találtuk, hogy a CLA dózisfüggő módon alakváltozást hoz létre a thrombocytákban, mely aggregometriával, valamint áramlási citometriai fényszórási és antigén expressziós vizsgálatokkal bizonyítható volt. | On ex vivo samples we examined 30 cases of stent implanted patients where in peripheral blood samples the following platelet activation markers were investigated: paletelt P-selectin, soluble P-selectin, CD63, heterotypic aggregates, microparticles. The above data were correlated with previous treatment protocol of the patients (ASA only or ASA and clopidogrel). Regarding studies with factor XIII we identified that in TRAP-activated platelets FXIII is elevated on the platelet surface. However, we proved, that FXIII is not derived from intracellular source but is attached from the plasma. By using specific fibrinogens we identified the biochemical requirements for FXIII binding to platelets. The manuscript was submitted to Thrombosis and Haemostasis where a minor revision was required. Regarding phosphatase inhibitors we found that phosphatase 1 and 2A types are both involved in platelet activation, since their simultaneous inhibition by calyculin is required to prevent TRAP-elicited P-selectin axpression and platelet aggregation. At the same time on non-activated platelet samples we found that calyculin dose-dependently inhibited platelet shape-change as measured by aggregometry and flow cytometry

Importance of P-Selectin Glycoprotein Ligand-1 in cell –cell interaction

A gyulladás és érelmeszesedés hátterében a vérlemezkék, fehérvérsejtek és endothel sejtek közti interakció áll. A vérlemezkéket a különböző sejtfelszíni receptoraikon keresztül, illetve szolubilis mediátorok által lehet aktiválni, melyek ezután központi szerepet játszanak a gyulladás kezdeti szakaszában és az endothel sejtek károsodásában. Ez a folyamat atherosclerotikus plakk kialakulásához vezethet, melynek következménye érelzáródás is lehet. A szívinfarktus, ischaemiás stroke és thrombosis a vezető halálokok közé tartoznak a fejlett világban. Ezekben a betegségekben közös, hogy az aktivált thrombocyták felszínén megjelenik a P-szelektin, mely kölcsönhatásba léphet a fehérvérsejtekkel a PSGL-1 molekulán keresztül, így heterotipikus aggregátumok keletkeznek. Ugyanezen ligand által kapcsolódnak a leukocyták az endothelsejtekhez. Kollagén és adrenalin együttes beadásával thrombotikus stimulust idéztünk elő állatkísérletes modellben és igazolni tudtuk, hogy a PSGL-1 hiányában az egerek túlélési esélyei jobbak. Két különböző mikroszkópos módszerrel kimutattuk, hogy a kialakult thrombusok száma kevesebb és ezek a thrombusok kevésbé zárják el az ereket a PSGL-1-/- egerekben. Ez a hatás a P-szelektin és PSGL-1 közti interakcióra vezethető vissza, mert ha blokkoltuk ezt a kapcsolódást, akkor kevesebb heterotipikus aggregátum keletkezett. A P-szelektin és PSGL-1 közti kapcsolatnak a myeloid sejtek csontvelőből történő mobilizációjában, illetve az érpályából történő kilépésében is jelentősége van. Napjainkban a hemopoetikus őssejtek mobilizációja elképzelhetetlen lenne a különböző mobilizáló ágensek (G-CSF, GM-CSF, AMD-3100) nélkül. Munkánk során bizonyítottuk, hogy PSGL-1 hiányában a myeloid progenitor sejtek gyorsabban kerülnek ki a csontvelőből a perifériára. Ciklofoszfamid kezelés után a granulocyta-macrophag kolóniaképző egységek (CFU-GM) száma is emelkedett a PSGL-1-/- állatok combcsontjában és ezzel párhuzamosan a perifériás vérben is emelkedett a CD34+/CD117+ őssejtek száma. Az eredményeink arra utalnak, hogy PSGL-1 hiányában a G-CSF hatékonyabban emelte meg a myeloid sejtek abszolút számát a perifériás vérben a csontvelőből történő gyorsabb mobilizáció, a keringő őssejtek érésének serkentése és az érpályából történő lassabb kilépés által.N