Insights into the spatiotemporal regulation of the cellular cytoskeleton through applications of FRET

Das zelluläre Cytoskelett besteht aus Mikrofilamenten, intermediären Filamenten, Mikrotubuli und einer Reihe von weiteren Proteinen, die seine von dem Zelltyp und von der Zellumgebung abhängige Dynamik kontrollieren. Proteine, die der Rho GTPase Familie angehören, spielen hierbei eine wichtige Rolle. Die RhoA GTPase, zum Beispiel, koordiniert gleichzeitig die Entstehung von Faserbündeln und fokalen Adhäsionen (FA). Die Faserbündel zeichnen sich durch ihre kontrahierenden, auf Aktomyosin basierenden Kräfte aus, die sich auf FA konzentrieren und damit zur Generation der zytoplasmischen Tension beitragen, die wiederum bestimmend für die Zellmorphologie, Adhäsion und Zellmigration ist. Basierend auf den Prinzipien des Förster Resonanz Energie Transfers (FRET) wurde ein optischer Biosensor konstruiert, um den Umfang aktiver, GTP-gebundener RhoA GTPase zu veranschaulichen, deren biochemiche Aktivität zur Entstehung physikalischer Kräfte im zellulären Cytoskelett führt. Der Biosensor wurde durch den Einsatz von alpha-Helices von sukzessiv wachsender Länge optimiert, die der linearen Extension für gute Orientierung (LEGO) dient. Somit wurde eine Methode für das rationale Design eines FRET Biosensors von hoher dynamischer Sensitivitätsreichweite entwickelt. Der beste RhoA GTPase Biosensor, LEGO10, zeigte einen Anstieg der FRET Effizienz, wenn RhoA in der GDP-gebundenen, inaktiven Form vorlag, während eine Verringerung der FRET Effizienz eintrat, wenn die GTP-gebundene Form von RhoA überwog. In FA enthaltene Integrin Moleküle sind integrale Membranproteine, die einen indirekten Kontakt zwischen dem Cytoskelett und der extrazellulären Matrix (EZM) herstellen, so dass ein kontinuierlicher Informationsaustausch zwischen der intra- und extrazellulären Umgebung stattfindet. Dieser Informationsaustausch ist bedeutsam für die Genexpression, das Zellwachstum, die Proliferation und die Zellmotilität. Um diesen Prozess erklären zu können, muss man die raumzeitliche Aktivitätsverteilung von Proteinen und die an dem bidirektionalen Cytoskelett-EZM Informationsaustausch beteiligten Signalkaskaden verstehen. Während der Zelladhäsion oder Zellmotilität müssen Aufbau, Erhalt und Abbau der Adhäsionskontakte mit der EZM koordiniert werden. Diese Kontakte sind für die Erzeugung und Durchleitung von Zugkräften besonders wichtig und unterstehen der Kontrolle der Rho GTPase Proteinfamilie. Um diese Kräfte näher zu erforschen, wurde eine auf Fibronektin basierende EZM konstruiert, die mit den FRET kompatiblen Cy3 und Cy5 Fluorophoren markiert war, so dass eine FRETing Matrix zustande kam. Gleichzeitig konnten GFP-markierte Cytoskelettkomponenten wie Aktin beobachtet werden, da genügend spektrale Separation zu den Cy3 und Cy5 Fluorophoren bestand. Die FRETing Matrix wurde eingesetzt, um raumzeitliche Aspekte der mechanischen Kraftausübung von Zellen während Adhäsion, Ausbreitung und Migration zu veranschaulichen. Umstrukturierungen innerhalb der FRETing Matrix, verursacht durch Kraftausübung der Zellen, bewirkten Änderungen in deren FRET Effizienz, die Rho GTPase abhängig waren und unterhalb von FA und Faserbündeln stattfanden. In den Anfangsstadien der Zellausbreitung - und zwar bevor die Zelle Adhäsionen zu der EZM etablierte - bildeten sich aufgrund von Aktinpolymerisation Ausstülpungen in der Zellmembran. Zelladhäsionen kamen erst in späteren Stadien der Ausbreitung zustande, durch die dann auch diejenigen Kräfte ausgeübt wurden, die zur Herstellung der innerzellulären Tension und Zellpolarität notwendig sind. Die FRETing Matrix wurde somit als ein Biosensor für die kontinuierliche und schnelle Veranschaulichung von Kräften etabliert, die während der dynamischen Interaktion von Zellen mit der EZM ausgeübt werden

Axonal degeneration in an Alzheimer mouse model is PS1 gene dose dependent and linked to intraneuronal Aβ accumulation

Abnormalities and impairments in axonal transport are suggested to strongly contribute to the pathological alterations underlying AD. The exact mechanisms leading to axonopathy are currently unclear, but it was recently suggested that APP expression itself triggers axonal degeneration. We used APP transgenic mice and crossed them on a hemi- or homozygous PS1 knock-in background (APP/PS1KI). Depending on the mutant PS1 dosage, we demonstrate a clear aggravation in both plaque-associated and plaque-distant axonal degeneration, despite of an unchanged APP expression level. Amyloid-ß (Aβ) peptides were found to accumulate in axonal swellings as well as in axons and apical dendrites proximate to neurons accumulating intraneuronal Aβ in their cell bodies. This suggests that Aβ can be transported within neurites thereby contributing to axonal deficits. In addition, diffuse extracellular Aβ deposits were observed in the close vicinity of axonal spheroids accumulating intracellular Aβ, which might be indicative of a local Aβ release from sites of axonal damage

Quantification of <i>in vivo</i> imaging results.

<p>Box plot of average fluorescence intensities over the lung area for all groups at 48-labeled anti-Siglec-F antibody injection. Lung intensities of EAAD mice are significantly higher (represented by asterisk *) compared with control mice and treated mice at 48 h and 72 h after antibody application; A = EAAD, C = control, AD = EAAD, dexamethasone treated, AE = EAAD, beta-escin treated.</p

Induction of EAAD and treatment schedule.

<p>Schematic depiction of the experimental protocol used for the induction of EAAD, the application of treatments and the optical imaging performed.</p

Modulation of dopamine uptake by nitric oxide in cultured mesencephalic neurons

Strong evidence obtained from in vivo and ex-vivo studies suggests the existence of interaction between dopaminergic and nitrergic systems. Some of the observations suggest a possible implication of nitric oxide (NO) in dopamine (DA) uptake mechanism. The present work investigated the interaction between both systems by examining the effect of an NO donor, sodium nitroprusside (SNP), associated with the indirect DA agonist, amphetamine (AMPH) on tritiated DA uptake in cultures of embryonic mesencephalic neurons. Consistent with the literature, both AMPH (1, 3 and 10 mu M) and SNP (300 mu M and 1 mM) inhibited DA uptake in a dose-dependent manner. In addition, the inhibition of DA uptake by AMPH (1 and 3 mu M) was significantly increased by the previous addition of SNP (300 mu M). The implication of NO in this interaction was supported by the fact that the free radical scavenger N-acetyl-L-Cysteine (500 mu M) significantly increased DA uptake and completely abolished the effect of SNP, leaving unaffected that from AMPH on DA uptake. Further, double-labeling immunohistochemistry showed the presence of tyrosine hydroxylase-(TH, marker for dopaminergic neurons) and neuronal NO synthase- (nNOS, marker for NO containing neurons) expressing neurons in mesencephalic cultures. Some dopaminergic neurons also express nNOS giving further support for a pre-synaptic interaction between both systems. This is the first work demonstrating in mesencephalic cultured neurons a combined effect of an NO donor and an indirect DA agonist on specific DA uptake. (C) 2008 Elsevier B.V. All rights reserved

Time course of NIRFlabeled anti-Siglec-F distribution in the lung.

<p><i>In vivo</i> lung scans of EAAD, control as well as dexamethasone and beta-escin treated animals before (prescan) and at 6 h, 24 h, 48 h and 72 h after antibody administration. Fluorescence intensity distribution is displayed in normalized counts (NC). In contrast to control mice (A, lower panel, n = 6), OVA-immunized mice have a marked accumulation of anti-SiglecF-750 within the lungs from 24 h, which decreases at 72 h (A, upper panel, n = 8). Anti-SiglecF-680 also reveals significant differences between EAAD (B, upper panel, n = 5) and control (B, lower panel, n = 4) fluorescence intensities derived from the lung. EAAD mice treated with either dexamethasone (C, upper panel, n = 5) or beta-escin (C, lower panel, n = 5) have low intensities over the lung, similar to healthy control mice (A and B, lower panels) at all scan times.</p

Time course of NIRF-labeled anti-Siglec-F distribution in the body.

<p><i>In vivo</i> representative full body scans of EAAD (upper panel, n = 8) and control (middle panel, n = 6) mice injected with 12 µg of anti-SiglecF-750, as well as EAAD mice injected with 12 µg of Alexa 750-labeled anti-IgG2a isotype control antibody (lower panel, n = 5) at the given time points. Fluorescence intensity distribution is displayed in normalized counts (NC). Excess anti-SiglecF-750 antibody accumulates within the liver (red elipse) and is excreted via the bladder (black arrows) within the first few hours after antibody administration. 24 h –48 h after anti-SiglecF-750 injection, EAAD mice, in contrast to all control animals, accumulate the Siglec-F-antibody in their lungs (yellow triangle).</p

Expression pattern of Siglec-F.

<p>Immunohistochemistry and immunofluorescence Siglec-F staining of lung sections and BAL cytospins of mice with EAAD (A - D, upper panels) and controls (A – D, lower panels). (A)– (B) represent sections of cryofrozen lungs stained with anti-Siglec-F antibody. (C) Representative images of cytospins from BAL stained with anti-Siglec-F antibody and (D) of cytospins from BAL fluid co-stained with anti-SiglecF-680 and anti-CD68. In EAAD lungs, Siglec-F is highly expressed in eosinophils surrounding the blood vessels (b/v) and airways (a/w) (A, upper panel), while control lungs are almost free of Siglec-F staining (A, lower panel), indicating the lack of immune cell infiltration. Higher magnification of EAAD lung sections demonstrates Siglec-F staining on eosinophils (arrows, bilobed nucleus) and macrophages (arrow heads) (B, upper panel). In cytospins, eosinophils (bilobed nucleus) from EAAD animals (C and D upper panel, arrows) demonstrate strong positive Siglec-F staining, whereas macrophages from both, EAAD and control animals (C, arrow heads and D, positive CD68 staining) show a variety of Siglec-F expression levels. Scale bars in A: 2.5 mm; in B–D: 5 µm.</p