Conformationnal stability and unfolding of the maltose binding protein

Nous avons étudié le couplage dépliement-transport de la Maltose Binding Protein (MBP ou MalE), une protéine périplasmique d'E. Coli et d'un mutant instable, le MalE219, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant, le chlorure de guanidium (GdnHCl) à l'échelle de la molécule unique. La technique utilisée est basée sur la détection électrique du transport de macromolécules à travers un nanopore protéique (l'Aérolysine d'Aeromonas Hydrophila) inséré dans une bicouche lipidique plane. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une précédente étude réalisée à travers un autre nanopore protéique, l'alpha-hémolysine du Staphylocoque doré, de géométrie et de charge nette différente. Nous avons montré l'existence de temps courts et longs de blocage du courant associés à des protéines dépliées ou partiellement repliées. La fréquence des blocages du courant permet d'obtenir la fraction de protéine dépliée passant à travers le pore en fonction de la concentration en GdnHCl. Les courbes de dénaturation obtenues avec les deux pores montrent un comportement sigmoïdale très similaire. Le type de pore n'influence donc pas la dénaturation des protéines, mais uniquement leur dynamique de transport. En revanche, la courbe de dénaturation du mutant instable présente un déplacement vers les concentrations plus faibles en GdnHCl. Il a été montré également que la présence du maltose comme ligand sur le MalE219 stabilise nettement sa structure. Pour La MBP, les temps de blocages longs diminuent avec l'augmentation de la concentration de GdnHCl montrant une dynamique de transition vitreuse . Cette technique est appropriée à l'étude du dépliement et des changements de conformation de protéines, mais ne permet pas d'obtenir des informations structurales sur les états intermédiaires de repliement. Ainsi, la spectroscopie RMN a été utilisée pour tenter de caractériser ces états intermédiaires de repliement, notamment par la méthode d'échange proton-deutérium. Elle consiste à suivre les cinétiques d'échange des résidus de la protéine sur des spectres 2D 1H-15N HSQC à différentes concentrations de GdnHCl.Ainsi 180 résidus sur les 370 que compte la MBP ont été suivis lors de la dénaturation en présence de GdnHCl. Les deux hélices en C-terminal sont très accessibles au solvant et se dénaturent facilement. La MBP est composée de deux domaines globulaires, le domaine N-ter et le domaine C-ter. Les éléments de structures secondaires situés dans la zone intermédiaire entre les deux domaines (principalement des brins β) sont particulièrement affectés par l'agent dénaturant. D'autres structures secondaires dans les domaines globulaires sont très protégées et plutôt stables. Il est donc proposé que les protéines partiellement dépliées s'insèrent dans le pore par l'extrémité C-terminal et que des parties de structuration tertiaire restent stable entraînant le blocage du pore.We study the unfolding-transport mechanism of the Maltose Binding Protein (MBP or MalE), a periplasm protein of E. Coli and a destabilised variant, the MalE219, as the function of the concentration of denaturing agent, Guanidine Hydrochloride(GdnHCl) at the single molecule level. The technique is based on the electrical detection of the macromolecule transport through a nanometer-scale channel, Aerolysin channel, inserted into a planar lipid bilayer. Results obtained were compared to previous data with another channel, the alpha-Hemolysin. Both channels have different geometry and net charge.We show that we can distinguish unfolded states from partially folded ones with aerolysin pore.Unfolded proteins induce short current blockades, their duration is constant as a function of the concentration of denaturing agent. Partially folded proteins exhibit long blockades whose life times decrease as the concentration of GdnHCl increase, this indicates a possible glassy dynamics.The frequency of the short current blockades increases as the concentration of denaturing agent increases, following a sigmoidal denaturation curve.The unfolding curve of native MBP with Aerolysin pore is similar to the one previously measured with Hemolysin channel. The denaturation curve of the destabilized variant obtained with Aerolysin is shifted towards lower value of GdnHCl concentration in agreement with bulk measurements. We show also that the addition of maltose stabilizes the structure of MalE219. This nanopore recording technique is also suitable for the study of unfolding and conformation changes of proteins.In order to obtain structural informations that nanopore recording cannot provides, the structure of MBP along its denaturation curve was studied by NMR spectroscopy. The Hydrogen-exchange method known to be sensitive to folding intermediates was specially used. It consists in tracking hydrogen-deuterium exchange rates for amino on the 2D 1H-15N HSQC spectra.Thus, 180 residus of 370 for MBP was followed during denaturation in the presence of GdnHCl. The two last helices in C-terminal of MBP are accessible to the solvent and are denaturated easily. MBP is a two domains protein, N-ter domain and C-ter domain. It was found out that the C- and D-domain of MBP (mainly alpha-helices) could be relatively stable in presence of denaturing agent and that beta strands which make the link between the two domains would be affected by the denaturing agent. It was proposed that partially unfolded proteins enter the pore by the C-terminal end and that stable tertiary structure still present block the pore

Stabilité conformationnelle et dépliement de la protéine MalE (Étude par nanopore et par spectroscopie RMN)

Nous avons étudié le couplage dépliement-transport de la Maltose Binding Protein (MBP ou MalE), une protéine périplasmique d'E. Coli et d'un mutant instable, le MalE219, en fonction de la concentration d'un agent dénaturant, le chlorure de guanidium (GdnHCl) à l'échelle de la molécule unique. La technique utilisée est basée sur la détection électrique du transport de macromolécules à travers un nanopore protéique (l'Aérolysine d'Aeromonas Hydrophila) inséré dans une bicouche lipidique plane. Les résultats obtenus ont été comparés à ceux obtenus lors d'une précédente étude réalisée à travers un autre nanopore protéique, l'alpha-hémolysine du Staphylocoque doré, de géométrie et de charge nette différente. Nous avons montré l'existence de temps courts et longs de blocage du courant associés à des protéines dépliées ou partiellement repliées. La fréquence des blocages du courant permet d'obtenir la fraction de protéine dépliée passant à travers le pore en fonction de la concentration en GdnHCl. Les courbes de dénaturation obtenues avec les deux pores montrent un comportement sigmoïdale très similaire. Le type de pore n'influence donc pas la dénaturation des protéines, mais uniquement leur dynamique de transport. En revanche, la courbe de dénaturation du mutant instable présente un déplacement vers les concentrations plus faibles en GdnHCl. Il a été montré également que la présence du maltose comme ligand sur le MalE219 stabilise nettement sa structure. Pour La MBP, les temps de blocages longs diminuent avec l'augmentation de la concentration de GdnHCl montrant une dynamique de transition vitreuse . Cette technique est appropriée à l'étude du dépliement et des changements de conformation de protéines, mais ne permet pas d'obtenir des informations structurales sur les états intermédiaires de repliement. Ainsi, la spectroscopie RMN a été utilisée pour tenter de caractériser ces états intermédiaires de repliement, notamment par la méthode d'échange proton-deutérium. Elle consiste à suivre les cinétiques d'échange des résidus de la protéine sur des spectres 2D 1H-15N HSQC à différentes concentrations de GdnHCl.Ainsi 180 résidus sur les 370 que compte la MBP ont été suivis lors de la dénaturation en présence de GdnHCl. Les deux hélices en C-terminal sont très accessibles au solvant et se dénaturent facilement. La MBP est composée de deux domaines globulaires, le domaine N-ter et le domaine C-ter. Les éléments de structures secondaires situés dans la zone intermédiaire entre les deux domaines (principalement des brins b) sont particulièrement affectés par l'agent dénaturant. D'autres structures secondaires dans les domaines globulaires sont très protégées et plutôt stables. Il est donc proposé que les protéines partiellement dépliées s'insèrent dans le pore par l'extrémité C-terminal et que des parties de structuration tertiaire restent stable entraînant le blocage du pore.We study the unfolding-transport mechanism of the Maltose Binding Protein (MBP or MalE), a periplasm protein of E. Coli and a destabilised variant, the MalE219, as the function of the concentration of denaturing agent, Guanidine Hydrochloride(GdnHCl) at the single molecule level. The technique is based on the electrical detection of the macromolecule transport through a nanometer-scale channel, Aerolysin channel, inserted into a planar lipid bilayer. Results obtained were compared to previous data with another channel, the alpha-Hemolysin. Both channels have different geometry and net charge.We show that we can distinguish unfolded states from partially folded ones with aerolysin pore.Unfolded proteins induce short current blockades, their duration is constant as a function of the concentration of denaturing agent. Partially folded proteins exhibit long blockades whose life times decrease as the concentration of GdnHCl increase, this indicates a possible glassy dynamics.The frequency of the short current blockades increases as the concentration of denaturing agent increases, following a sigmoidal denaturation curve.The unfolding curve of native MBP with Aerolysin pore is similar to the one previously measured with Hemolysin channel. The denaturation curve of the destabilized variant obtained with Aerolysin is shifted towards lower value of GdnHCl concentration in agreement with bulk measurements. We show also that the addition of maltose stabilizes the structure of MalE219. This nanopore recording technique is also suitable for the study of unfolding and conformation changes of proteins.In order to obtain structural informations that nanopore recording cannot provides, the structure of MBP along its denaturation curve was studied by NMR spectroscopy. The Hydrogen-exchange method known to be sensitive to folding intermediates was specially used. It consists in tracking hydrogen-deuterium exchange rates for amino on the 2D 1H-15N HSQC spectra.Thus, 180 residus of 370 for MBP was followed during denaturation in the presence of GdnHCl. The two last helices in C-terminal of MBP are accessible to the solvent and are denaturated easily. MBP is a two domains protein, N-ter domain and C-ter domain. It was found out that the C- and D-domain of MBP (mainly alpha-helices) could be relatively stable in presence of denaturing agent and that beta strands which make the link between the two domains would be affected by the denaturing agent. It was proposed that partially unfolded proteins enter the pore by the C-terminal end and that stable tertiary structure still present block the pore.CERGY PONTOISE-Bib. electronique (951279901) / SudocSudocFranceF

Temperature Effect on Ionic Current and ssDNA Transport through Nanopores

International audienceWe have investigated the role of electrostatic interactions in the transport of nucleic acids and ions through nanopores. The passage of DNA through nanopores has so far been conjectured to involve a free-energy barrier for entry, followed by a downhill translocation where the driving voltage accelerates the polymer. We have tested the validity of this conjecture by using two toxins, α-hemolysin and aerolysin, which differ in their shape, size, and charge. The characteristic timescales in each toxin as a function of temperature show that the entry barrier is ∼15kBT and the translocation barrier is ∼35kBT, although the electrical force in the latter step is much stronger. Resolution of this fact, using a theoretical model, reveals that the attraction between DNA and the charges inside the barrel of the pore is the most dominant factor in determining the translocation speed and not merely the driving electrochemical potential gradient

DNA Unzipping and Protein Unfolding Using Nanopores

International audienc

Mapping the Conformational Stability of Maltose Binding Protein at the Residue Scale Using Nuclear Magnetic Resonance Hydrogen Exchange Experiments

International audienceBeing able to differentiate local fluctuations from global folding−unfolding dynamics of a protein is of major interest for improving our understanding of structure−function determinants. The maltose binding protein (MBP), a protein that belongs to the maltose transport system, has a structure composed of two globular domains separated by a rigid-body “hinge bending”. Here we determined, by using hydrogen exchange (HX) nuclear magnetic resonance experiments, the apparent stabilization free energies of 101 residues of MBP bound to β-cyclodextrin (MBP−βCD) under native conditions. We observed that the last helix of MBP (helix α14) has a lower protection factor than the rest of the protein. Further, HX experiments were performed using guanidine hydrochloride under subdenaturing conditions to discriminate between local fluctuations and global unfolding events and to determine the MBP−βCD energy landscape. The results show that helix α4 and a part of helices α5 and α6 are clearly grouped into a subdenaturing folding unit and represent a partially folded intermediate under native conditions. In addition, we observed that amide protons located in the hinge between the two globular domains share similar ΔGgu app and m values and should unfold simultaneously. These observations provide new points of view for improving our understanding of the thermodynamic stability and the mechanisms that drive folding−unfolding dynamics of proteins