Biorecognition by amino acid-based affinity chromatography for RNA purification

Following the decoding of the human genome, a new era was opened for developing new gene therapy strategies employing nucleic acids. Recently, RNA was renowned a central molecule in cellular processes with implications in many diseases as well as in understanding of evolution, becoming one of the most exciting research areas of molecular biology. From basic to applied research, many procedures employ pure and intact RNA molecules. On one hand, RNA purification is a first critical step of a number of molecular biology procedures and its quality is crucial to ensure reproducibility and biological relevance of an experiment. On the other hand, the promising and revolutionary RNA-based therapies of RNA vaccination, gene therapy or recombinant biopharmaceuticals involves RNA formulations which should fulfill rigorous quality criteria recommended by international regulatory agencies. However, the isolation and purification of RNA are critical steps because of the easy degradability of RNA, which can impair chemical stability and biological functionality essential for analysis. Many techniques have been development to overcome the challenges of purifying RNA molecules; nonetheless they still have several limitations in regard to time demanding and the requirement of toxic solvents and denaturing conditions. Therefore, there is a growing demand for the evaluation and improvement of the methodologies currently used for RNA isolation and purification. Chromatography is undoubtedly one of the most diverse and potent methods in biotechnology, both at analytical, preparative and industrial level due to its simplicity, robustness, versatility and high reproducibility. Affinity chromatography is recognized as a powerful technique with great applicability in the purification of many biomolecules, including plasmid DNA and proteins because it exploits the principle of biomolecular recognition. The work that we have been developing considers new chromatographic strategies for RNA purification, using amino acids as affinity ligands. These studies are based on the fact that many different interactions exist between proteins and nucleic acids in biological systems, involving in particular basic amino acids such as histidine or arginine. New methodologies were accomplished that allowed obtaining RNA preparations from different sources with high recovery yields, purity and integrity. A new analytical method for RNA quantification was also developed in this work. The applicability of histidine-based affinity chromatography in the purification of RNA molecules was first demonstrated in the separation of 6S RNA, a regulatory non-coding RNA of the prokaryotic Escherichia coli (E.coli). A specific recognition between the histidine support and 6S RNA allowed its selective purification from a complex mixture of other small RNAs (sRNA). In another strategy, the simultaneous isolation of sRNA and ribosomal RNA from E.coli cell lysates, eliminating host DNA and proteins, was also attained by a histidine chromatographic-based method. Furthermore, arginine matrix was employed in RNA purification from eukaryotic cells demonstrating an exceptional ability to interact with all functional classes of RNA, despite their structural diversity and different folding states, enabling their isolation from impurities of eukaryotic crude cell extracts. Moreover, an analytical technique based on arginine affinity support for quantification and quality assessment of total RNA from different eukaryotic cells and synthetic RNA samples was also developed and validated, according to international and European legislation for bioanalytical methods. More efforts into RNA purification were developed with amino acid-based matrices, in particular with arginine-agarose matrix, in order to approach this technique to therapeutic application of RNA. The new goal was to exploit its applicability in purifying messenger RNA (mRNA) molecules not from cells, but from synthetic crudes of in vitro transcription reactions, pursuing mRNA vaccination for cervical cancer. In this work, arginine-based chromatography also showed its singular capability to improve purification processes, showing the advantages of eliminating additional steps and improving global economics of the production process. The development of these new methodologies revealed several interesting characteristics of RNA molecules, including their chromatographic behavior and natural interactions that can occur between amino acids-based supports and RNA molecules. Accordingly, these methods demonstrated a potential multipurpose applicability by aiding in molecular biology RNA-based analysis and RNA therapeutics, which support the interest in applying amino acid-based affinity chromatography for the future development of new RNA isolation, purification and quantification processes.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

O2/CO2-sensitive cyclic AMP-signalling pathway in peripheral chemoreceptors

RESUMO: O corpo carotídeo (CB) é um pequeno órgão sensível a variações na PaO2, PaCO2 e pH. As células tipo I (células glómicas) do corpo carotídeo, as unidades sensoriais deste órgão, libertam neurotransmissores em resposta às variações dos gases arteriais. Estes neurotransmissores atuam quer em recetores pré-sinápticos, localizados nas células tipo I, quer em recetores póssinápticos, localizados nas terminações do nervo do seio carotídeo, ou em ambos. A activação dos recetores pré-sinápticos modula a atividade do corpo carotídeo, enquanto que, a activação dos recetores pós-sinápticos, de carater excitatório, desencadeia um aumento da frequência de descarga das fibras do CSN, com subsequente despolarização dos neurónios do gânglio petroso, e posterior despolarização de um grupo específico de neurónios do centro respiratório central, desencadeando, como resposta final, hiperventilação. Estes recetores pré- e pós-sinápticos podem ser classificados em ionotrópicos ou metabotrópicos, estando os últimos acoplados a adenilatos ciclases transmembranares (tmAC). O mecanismo exato pelo qual as variações dos gases arteriais são detetadas pelo CB não se encontra ainda completamente elucidado, mas tem sido sugerido que alterações nos níveis de cAMP estejam associadas ao mecanismo de deteção de variações de O2 e CO2. Os níveis de cAMP podem ser regulados através da sua via de síntese, mediada por dois tipos de adenilatos ciclases: tmAC sensível aos eurotransmissores e adenilato ciclase solúvel (sAC)sensível a variações de HCO3/CO2, e pela sua via de degradação mediada por fosfodiesterases. A via de degradação do cAMP pode ser manipulada farmacologicamente, funcionando enquanto alvo terapêutico para o tratamento de patologias do foro respiratório (e.g. asma, hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstructiva crónica e apneia do sono), que induzem um aumento da actividade do CB.O trabalho descrito nesta dissertação partiu da hipótese de que a actividade do CB é manipulada por fármacos, que interferem com a via de sinalização do cAMP, tendo sido nosso objectivo geral, investigar o papel do cAMP na quimiotransdução do CB de rato, e determinar se a actividade dos enzimas responsáveis pela via de sinalização do cAMP é ou não regulada por variações de O2/CO2. Assim, a relevância deste trabalho é a de estudar e identificar possíveis alvos moleculares (sAC, isoformas de tmAC e PDE) com potencial para serem usados no tratamento de patologias relacionadas com o controlo respiratório. A primeira parte do presente trabalho, centrou-se na caracterização farmacológica da PDE4 no CB e em tecidos não quimiorecetores (e.g. gânglio cervical superior e artérias carótidas), e na observação do efeito de hipóxia aguda na acumulação dos níveis de cAMP, induzidos pelos inibidores de PDE, nestes tecidos. A quantificação de cAMP foi efectuada por técnica imunoenzimática (EIA), tendo sido elaboradas curvas de dose-resposta para os efeitos de inibidores, não específicos (IBMX) e específicos para a PDE2 e PDE4 (EHNA, Rolipram e Ro 20-1724), nos níveis de cAMP acumulados, em situações de normóxia (20%O2/5%CO2) e hipóxia (5%O2/5%CO2). A caracterização das PDE no gânglio cervical superior foi aprofundada, utilizando-se a técnica de transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) em culturas primárias de neurónios, na presença de inibidores não específicos (IBMX) e específicos para a PDE3 e PDE4 (milrinone e rolipram, respetivamente). Foram igualmente estudadas, através de RT-qPCR, as alterações na expressão de PDE3A-B e PDE4A-D, no gânglio cervical superior, em resposta a diferentes percentagens de oxigénio. Na segunda parte do trabalho investigou-se a via de síntese do cAMP no CB em resposta a variações na concentração de HCO3/CO2. Em concreto, o protocolo experimental centrou-se na caracterização da sAC, dado que a sua actividade é regulada por variações de HCO3/CO2. A caracterização da expressão e regulação da sAC, em resposta a variações de HCO3/CO2 ,foi efectuada no CB e em tecidos não quimioreceptores periféricos (e.g. gânglio cervical superior, petroso e nodoso) por qRT-PCR. A actividade deste enzima foi caracterizada indirectamente através da quantificação dos níveis de cAMP (quantificação por EIA), induzidos por diferentes concentrações de HCO3/CO2, na presença de MDL-12,33-A, um inibidore da tmAC. A expressão das isoformas da tmAC no CB e gânglio petroso foi determinada por RT-qPCR. Adicionalmente, estudámos a contribuição relativa da tmAC e sAC no mecanismo de sensibilidade ao CO2 no CB. Para o efeito foram estudadas as alterações: 1) nos níveis de cAMP (quantificado por EIA) na presença de diferentes concentrações de HCO3/CO2 e ao longo do tempo (5-30 min); 2) na ativação da proteína cinase A (PKA, FRET baseado em sensores) em células tipo I do CB; e 3) na frequência de descarga do CSN (registos) na presença e ausência de ativadores e inibidores da sAC,tmAC e PKA. Por último, foi caracterizada a expressão e actividade da sAC nos quimioreceptors centrais (locus ceruleus, rafe e medula ventro-lateral) através de técnicas de RT-qPCR e EIA. A expressão das isoformas da tmAC foi aprofundada no locus coeruleus através de RT-qPCR. Por fim, comparámos a contribuição da tmAC e sAC nos níveis de cAMP no locus coeruleus em condições de normocapnia e hipercapnia.O nosso trabalho teve os seguintes resultados principais: 1) PDE4 está funcional no corpo carotídeo, artérias carótidas e gânglio cervical superior de rato, embora a PDE2 só se encontre funcional neste último; 2) Os efeitos dos inibidores de PDE nos níveis de acumulação de cAMP foram exacerbados em situações de hipóxia aguda no CB e artérias carótidas, mas foram atenuados no gânglio cervical superior; 3) No gânglio cervical superior, diferentes tipos de células apresentaram uma caracterização específica de PDEs, sugerindo uma subpopulação de células neste gânglio com funções fisiológicas distintas; 4) Embora todas as isoformas de PDE4 e PDE3 estivessem presentes no gânglio, a PDE3a, PDE4b e a PDE4d foram as isoformas mais expressas. Por outro lado, incubações de gânglio cervical superior, em diferentes percentagens de oxigénio, não alteraram (não regularam) significativamente a expressão das diferentes isoformas de PDE neste órgão; 5) a sAC encontra-se expressa e funcional no CB e nos quimiorecetores centrais estudados (locus coeruleus, rafe e medula ventrolateral). A sAC apresenta maior expressão no CB comparativamente aos restantes orgãos estudados, exceptuando os testículos, orgão controlo. Variações de HCO3/CO2 de 0/0 para 24/5 aumentaram os níveis de cAMP no CB e quimiorecetores centrais, tendo sido o aumento mais significativo observado no CB. Concentrações acima dos 24mM HCO3/5%CO2 não induziram alterações nos níveis de cAMP, sugerindo que a actividade da sAC se encontra saturada em condições fisiológicas (normocapnia) e que este enzima não desempenha qualquer papel na deteção de situações de hipercapnia; 6) No CB, a expressão das isoformas tmAC1, tmAC4, tmAC6 e tmAC9 é mais elevada comparativamente à expressão da sAC; 7) Utilizamos diferentes inibidores da tmAC (MDL 12-330A, 500μM, 2’5’-ddADO, 30-300μM, SQ 22536, 200μM) e da sAC (KH7, 10-100μM) para estudar a contribuição relativa destes enzimas na acumulação do cAMP no CB. Tanto a tmAC como a sAC contribuem para a acumulação dos níveis de cAMP em condições de hipercapnia. Contudo, existe um maior efeito destes inibidores nas condições de 12 mM HCO3/2.5%CO2 do que em condições de normocapnia e hipercapnia, sugerindo um papel relevante destes enzimas na atividade do CB em situações de hipocapnia; 8) Não se observaram variações nos níveis de cAMP em resposta a diferentes concentrações de HCO3/CO2 ao longo do tempo (5-30 min). O efeito inibitório induzido por ddADO e KH7 foi sobreponível após 5 ou 30 minutos de incubação em todas as concentrações de HCO3/CO2 estudadas; 9) Por último, verificou-se um aumento na frequência da descarga do nervo do seio carotídeo entre as condições de normocapnia e hipercapnia acídica. Ao contrário do KH7 (10μM), o 2’5’-ddADO reduziu significativamente a frequência de descarga do nervo, quer em condições de normocapnia quer de hipercapnia acídica. Contudo, não se verificou aumento na frequência de descarga do nervo entre normocapnia e hipercapnia isohídrica, sugerindo que a sensibilidade à hipercapnia no CB é mediada por variações de pH. Em conclusão, os resultados decorrentes deste trabalho permitiram demonstrar que, embora os enzimas que medeiam a via de sinalização do cAMP possam ser bons alvos terapêuticos em condições particulares, a sua actividade não é específica para o CB. Os resultados sugerem ainda que o cAMP não é um mediador específico da transdução à hipercapnia neste orgão. Contudo, os nossos resultados demonstraram que os níveis de cAMP são mais elevados em condições fisiológicas, o que sugere que o cAMP possa ter uma função homeostática neste orgão. Por último, o presente trabalho demonstrou que os aumentos de cAMP descritos por outros em condições de hipercapnia, não são observáveis quando o pH se encontra controlado. ------------------ ABSTRACT: The work presented in this dissertation was aimed to establish how specific is cAMP-signaling pathways in the CB mainly in different CO2 conditions and how O2 concentrations alter/drives the manipulation of cAMP signaling in the CB. The experimental studies included in this thesis sought to investigate the role of cAMP in the rat CB chemotransduction mechanisms and to determine whether the enzymes that participate in cAMP signal transduction in the CB are regulated by O2/CO2. We characterized the enzymes involved in the cAMP-signaling pathway in the CB (sAC, tmAC, PDE) under different O2/CO2 conditions. Our results demonstrated that many of these enzymes are involved in CO2/O2 sensing and while they may be useful in treating conditions with alterations in CO2/O2 sensing,they will not be specific to chemoreception within the CB: 1) PDE4 is ubiquitously expressed in CB and non-chemoreceptor related tissues and their affinity to inhibitors change with O2 tensions in both CB and carotid arteries, and 2) sAC and tmAC are expressed in peripheral and central chemo- and non-chemoreceptor tissues and their effect on cAMP levels do not change between normocapnic and isohydric hypercapnic conditions. Our results provide evidence against a specific role of cAMP as a mediator for O2 and CO2 chemotransduction in the rat CB and emphasized the role of pH in CO2 sensitivity of the CB. Furthermore, our results demonstrate that cAMP levels are maintained higher under physiological conditions, supporting recent finding from our lab, which all together suggests that cAMP has a homeostatic function in this organ

Purificação de RNA por cromatografia de afinidade com histidina imobilizada

O recente desenvolvimento da terapia génica surge como uma nova abordagem para o potencial tratamento de doenças consideradas incuráveis. Apesar destas estratégias se terem iniciado com DNA, investigações recentes tem avaliado o potencial interesse terapêutico do RNA. No entanto, os protocolos disponível para o isolamento do RNA são limitados, morosos e requerem o uso de solventes tóxicos, o que tornam estes procedimentos inadequados para recuperar o produto a ser biologicamente aplicado. O principal objectivo deste estudo é investigar a aplicabilidade da cromatografia de afinidade com histidina imobilizada no isolamento do RNA. Uma vez que o RNA, tal como o DNA, tem a capacidade de se ligar à matriz de histidina-agarose, esta interacção pode ser explorada para purificar especificamente os diferentes RNAs, atendendo às suas propriedades estruturais. Para concretizar o objectivo, o RNA total foi isolado da Escherichia coli DH5α usando a extracção com tiocianato de guanidina- fenol/clorofórmio e a separação do RNA ribossómico (rRNA) e do RNA de baixo peso molecular (sRNA) foi promovida por precipitação com 2M de sulfato de amónio a 4ºC. Os estudos dos perfis cromatográficos das espécies de sRNA e de rRNA na matriz de histidina-agarose com diferentes concentrações de sulfato de amónio revelaram que para os dois tipos de RNA, as elevadas concentrações de sal promoviam a ligação do RNA à matriz, e a diminuição da força iónica promovia a sua eluição. Com este estudo foi possível desenvolver uma estratégia para a purificação do RNA 6S aplicando um gradiente decrescente de sulfato de amónio por passos. Após a ligação dos sRNAs à matriz de histidina, a diminuição da concentração de sal permite a separação de outros tipos de RNA e a remoção do sal na eluição promove a recuperação do RNA 6S. Este tipo de RNA foi recentemente identificado como estando envolvido no processo de transcrição, pelo que a purificação é uma mais valia para a sua caracterização estrutural e funcional.Severe diseases that currently remain untreatable are strong candidates to novel genebased treatments. Although the gene-based therapeutic strategies started to be developed using DNA, a large number of studies are in progress in which the therapeutic potential of RNA is evaluated. However, the available protocols for isolation of RNA are limited, time-consuming and require the use of toxic solvents. All these reasons make these procedures not adequate to recover a product to be biologically applied and motivate the research for an efficient, tolerable and scalable process to purify RNA. The main purpose of this study is the investigation of the applicability of a recently established method based on affinity chromatography with amino acids as specific ligands, to isolate RNA species. As the histidine-agarose support is able to bind the RNA, this interaction can be exploited to specifically purify different RNAs, considering their structural particularities. Total RNA was isolated from Escherichia coli DH5α by guanidinium-thiocyanatephenol-chloroform extraction and ribosomal RNAs (rRNAs) and small RNAs (sRNAs) were obtained by ammonium sulphate precipitation at 4ºC. The different RNAs were then applied to a histidine-agarose support with different ammonium sulphate concentrations in order to understand their retention pattern. In both RNA classes, the higher salt concentrations promoted RNA binding to histidine-agarose matrix, while lower ionic strength caused its elution. In this study, we were also able to establish a strategy for the purification of the 6S RNA, using a decreasing stepwise elution gradient. The higher salt concentrations promoted sRNAs binding to the histidine support, and the decrease of ammonium sulphate concentration caused the elution of some RNA species. Finally, the removal of ammonium sulphate from the elution buffer allowed the recovery of 6S RNA. This type of RNA was recently recognized in the transcription process and its purification is of great importance for further structural and functional studies

A musealização de heranças difíceis : o caso do Museu do Aljube - Resistência e Liberdade

Com o conhecimento da existência de museus a nível internacional dedicados a heranças difíceis, isto é, a passados indesejados e traumáticos, na maioria caraterizados pela violência e opressão, como o Holocausto, o objetivo desta dissertação foi primeiramente realizar um estado da arte sobre este assunto, definindo vários conceitos importantes que, numa segunda parte, foram aplicados à realidade portuguesa, mais precisamente, ao recente Museu do Aljube-Resistência e Liberdade, em Lisboa, dedicado à herança difícil portuguesa da ditadura, analisando-o como um museu de herança difícil ou museu-memorial assente não numa coleção mas antes num espaço performativo.With the knowledge of the existence of international museums dedicated to difficult heritage, that is, to unwanted and traumatic pasts, most characterized by violence and oppression, like the Holocaust, the main goal of this work was first establish the state of art about this matter by defining a number of important concepts that, in a second part, were applied to the Portuguese reality, more precisely, to the recent Museu do Aljube- Resistência e Liberdade, in Lisbon, dedicated to the difficult heritage of Portuguese dictatorship, analyzing it as a museum of difficult heritage or memorial-museum based not on a collection but instead in a performative space

Metal oxide-based photocatalytic paper: A green alternative for environmental remediation

The interest in advanced photocatalytic technologies with metal oxide-based nanomaterials has been growing exponentially over the years due to their green and sustainable characteristics. Photocatalysis has been employed in several applications ranging from the degradation of pollutants to water splitting, CO2 and N2 reductions, and microorganism inactivation. However, to maintain its eco-friendly aspect, new solutions must be identified to ensure sustainability. One alternative is creat-ing an enhanced photocatalytic paper by introducing cellulose-based materials to the process. Paper can participate as a substrate for the metal oxides, but it can also form composites or membranes, and it adds a valuable contribution as it is environmentally friendly, low-cost, flexible, recyclable, lightweight, and earth abundant. In term of photocatalysts, the use of metal oxides is widely spread, mostly since these materials display enhanced photocatalytic activities, allied to their chemical stability, non-toxicity, and earth abundance, despite being inexpensive and compatible with low-cost wet-chemical synthesis routes. This manuscript extensively reviews the recent developments of using photocatalytic papers with nanostructured metal oxides for environmental remediation. It focuses on titanium dioxide (TiO2) and zinc oxide (ZnO) in the form of nanostructures or thin films. It discusses the main characteristics of metal oxides and correlates them to their photocatalytic activity. The role of cellulose-based materials on the systems’ photocatalytic performance is extensively discussed, and the future perspective for photocatalytic papers is highlighted.publishersversionpublishe

Seed-Layer Free Zinc Tin Oxide Tailored Nanostructures for Nanoelectronic Applications: Effect of Chemical Parameters

POCI-01-0145-FEDER-007688Semiconductor nanowires are mostly processed by complex, expensive, and high temperature methods. In this work, with the intent of developing zinc tin oxide nanowires (ZTO NWs) by low-cost and low-complexity processes, we show a detailed study on the influence of chemical parameters in the hydrothermal synthesis of ZTO nanostructures at temperatures of only 200 degrees C. Two different zinc precursors, the ratio between zinc and tin precursors, and the concentration of the surfactant agent and of the mineralizer were studied. The type and the crystallinity of the nanostructures were found to be highly dependent on the used precursors and on the concentration of each reagent. Conditions for obtaining different ZTO nanostructures were achieved, namely, Zn2SnO4 nanoparticles and ZnSnO3 nanowires with length similar to 600 nm, with the latter being reported for the first time ever by hydrothermal methods without the use of seed layers. Optical and electrical properties were analyzed, obtaining band gaps of 3.60 and 3.46 eV for ZnSnO3 and Zn2SnO4, respectively, and a resistivity of 1.42 k Omega.cm for single ZnSnO3 nanowires, measured using nanomanipulators after localized deposition of Pt electrodes by e-beam assisted gas decomposition. The low-temperature hydrothermal methods explored here proved to be a low-cost, reproducible, and highly flexible route to obtain multicomponent oxide nanostructures, particularly ZTO NWs. The diversity of the synthesized ZTO structures has potential application in next-generation nanoscale devices such as field effect nanotransistors, nanogenerators, resistive switching memories, gas sensors, and photocatalysis.proofpublishe

Banking in the portuguese colonial empire (1864-1975)

This paper provides a general view of the evolution of banking in the Portuguese Colonial Empire between the founding of the first Portuguese colonial bank in 1864 and the independence of most Portuguese colonies in 1975. The text summarizes the legal background, presents the banks existing during that period, examines their businesses and discusses their contribution to the economic evolution of the territories under consideration. As the paper's main conclusions, it may be said that: (i) Portuguese colonial banking followed the continental model of government initiative and tight control, not the British model of private initiative without much government control; (ii) the development of Portuguese colonial banking was always mainly a matter of profiting from the opportunities afforded by economic evolution rather than a matter of autonomously fostering the economic development of the territories

Acorn flour from holm oak (Quercus rotundifolia): Assessment of nutritional, phenolic, and technological profile

Acorn is the fruit of holm oak (Quercus rotundifolia), being mainly used nowadays to feed animals, however a substantial part remains in the fields without any valorization. Underexploited crops are gaining new interest, driven by food security concerns and health benefits potential as well. In the present work, it was studied the physicochemical characteristics and functional perspective of acorn flour, as an ingredient for human diet. The study included nutritional composition analysis, phenolic compounds profile through HPLC, starch content and its microstructure, fibre, and pasting properties assessment. Acorn flour presented a high content in fat, particularly monounsaturated and polyunsaturated (oleic and linoleic acids), and high minerals content in particular K. Concerning phenolic profile, rutin, catechin, ellagic acid, gallic acid, and syringic acid were identified. In regards to technological profile, fibre was mainly insoluble, with around 11%, and starch content was 50%. Its pasting behaviour revealed a high gelatinization temperature (85 ◦C), with low breakdown, and higher retrogradation consistency. These results show acorn flour potential as a valuable and sustainable multipurpose food ingredientinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio

Apple Flour in a Sweet Gluten-Free Bread Formulation: Impact on Nutritional Value, Glycemic Index, Structure and Sensory Profile

Baking bread without gluten presents many challenges generally related with poor sensorial and nutritional characteristics, and strategies to overcome this issue are needed. Despite many glutenfree (GF) bread studies, to the best of our knowledge, few are dedicated to sweet GF bread. Sweet breads have traditionally been an important type of food and are still frequently consumed worldwide. Apple flour is naturally GF, and is obtained from apples which do not accomplish market quality requirements and are being wasted. Apple flour was, therefore, characterized in terms of nutritional profile, bioactive compounds, and antioxidant capacity. The aim of this work was to develop a GF bread with incorporation of apple flour, in order to study its effect on nutritional, technological, and sensory characteristics of sweet GF bread. Additionally, in vitro starch hydrolysis and glycemic index (GI) were also analyzed. Results demonstrated the influence of apple flour in dough’s viscoelastic behavior, increasing G’ and G”. Regarding bread characteristics, apple flour led to better acceptance by the consumer, with firmness increasing (21.01; 26.34; 23.88 N), and consequently specific volume decreasing (1.38; 1.18; 1.13 cm3/g). In addition, an increase of bioactive compounds content and antioxidant capacity of the breads were revealed. As expected, the starch hydrolysis index increased, as well as GI. Nevertheless the values were really close to low eGI (56), which is a relevant result for a sweet bread. Apple flour showed good technological and sensory properties as a sustainable and healthy food ingredient for GF breadinfo:eu-repo/semantics/publishedVersio