Boundary region between coexisting lipid phases as initial binding sites for Escherichia coli alpha-hemolysin: A real-time study

α-Hemolysin (HlyA) is a protein toxin, a member of the pore-forming Repeat in Toxin (RTX) family, secreted by some pathogenic strands of Escherichia coli. The mechanism of action of this toxin seems to involve three stages that ultimately lead to cell lysis: binding, insertion, and oligomerization of the toxin within the membrane. Since the influence of phase segregation on HlyA binding and insertion in lipid membranes is not clearly understood, we explored at the meso- and nanoscale - both in situ and in real-time - the interaction of HlyA with lipid monolayers and bilayers. Our results demonstrate that HlyA could insert into monolayers of dioleoylphosphatidylcholine/sphingomyelin/cholesterol (DOPC/16:0SM/Cho) and DOPC/24:1SM/Cho. The time course for HlyA insertion was similar in both lipidic mixtures. HlyA insertion into DOPC/16:0SM/Cho monolayers, visualized by Brewster-angle microscopy (BAM), suggest an integration of the toxin into both the liquid-ordered and liquid-expanded phases. Atomic-force-microscopy imaging reported that phase boundaries favor the initial binding of the toxin, whereas after a longer time period the HlyA becomes localized into the liquid-disordered (Ld) phases of supported planar bilayers composed of DOPC/16:0SM/Cho. Our AFM images, however, showed that the HlyA interaction does not appear to match the general strategy described for other invasive proteins. We discuss these results in terms of the mechanism of action of HlyA.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y AplicadasFacultad de Ciencias Exacta

Impact of sphingomyelin acyl chain (16:0 vs 24:1) on the interfacial properties of Langmuir monolayers: A PM-IRRAS study

Membrane structure is a key factor for the cell`s physiology, pathology, and therapy. Evaluating the importance of lipid species such as N-nervonoyl sphingomyelin (24:1-SM) -able to prevent phase separation- to membrane structuring remains a formidable challenge. This is the first report in which polarization-modulated infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) is applied to investigate the lipid-lipid interactions in 16:0 vs 24:1-SM monolayers and their mixtures with 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and cholesterol (Chol) (DOPC/SM/Chol 2:1:1). From the results we inferred that the cis double bond (Δ15) in 24:1-SM molecule diminishes intermolecular H-bonding and chain packing density compared to that of 16:0-SM. In ternary mixtures containing 16:0-SM, the relative intensity of the two components of the Amide I band reflected changes in the H-bonding network due to SM-Chol interactions. In contrast, the contribution of the main components of the Amide I band in DOPC/24:1-SM/Chol remained as in 24:1-SM monolayers, with a larger contribution of the non-H-bonded component. The most interesting feature in these ternary films is that the CO stretching mode of DOPC appeared with an intensity similar to that of SM Amide I band in DOPC/16:0-SM/Chol monolayers (a two-phase [Lo/Le] system), whereas an extremely low intensity of the CO band was detected in DOPC/24:1-SM/Chol monolayers (single Le phase). This is evidence that the unsaturation in 24:1-SM affected not only the conformational properties of acyl chains but also the orientation of the chemical groups at the air/water interface. The physical properties and overall H-bonding ability conferred by 24:1-SM may have implications in cell signaling and binding of biomolecules.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicada

Boundary region between coexisting lipid phases as initial binding sites for Escherichia coli alpha-hemolysin: A real-time study

Abstractα-Hemolysin (HlyA) is a protein toxin, a member of the pore-forming Repeat in Toxin (RTX) family, secreted by some pathogenic strands of Escherichia coli. The mechanism of action of this toxin seems to involve three stages that ultimately lead to cell lysis: binding, insertion, and oligomerization of the toxin within the membrane. Since the influence of phase segregation on HlyA binding and insertion in lipid membranes is not clearly understood, we explored at the meso- and nanoscale—both in situ and in real-time—the interaction of HlyA with lipid monolayers and bilayers. Our results demonstrate that HlyA could insert into monolayers of dioleoylphosphatidylcholine/sphingomyelin/cholesterol (DOPC/16:0SM/Cho) and DOPC/24:1SM/Cho. The time course for HlyA insertion was similar in both lipidic mixtures. HlyA insertion into DOPC/16:0SM/Cho monolayers, visualized by Brewster-angle microscopy (BAM), suggest an integration of the toxin into both the liquid-ordered and liquid-expanded phases. Atomic-force-microscopy imaging reported that phase boundaries favor the initial binding of the toxin, whereas after a longer time period the HlyA becomes localized into the liquid-disordered (Ld) phases of supported planar bilayers composed of DOPC/16:0SM/Cho. Our AFM images, however, showed that the HlyA interaction does not appear to match the general strategy described for other invasive proteins. We discuss these results in terms of the mechanism of action of HlyA

Impact of sphingomyelin acyl chain (16:0 vs 24:1) on the interfacial properties of Langmuir monolayers: a PM-IRRAS study

Membrane structure is a key factor for the cell`s physiology, pathology, and therapy. Evaluating the importance of lipid species such as N-nervonoyl sphingomyelin (24:1-SM) —able to prevent phase separation— to membrane structuring remains a formidable challenge. This is the first report in which polarization-modulated infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) is applied to investigate the lipid-lipid interactions in 16:0 vs 24:1-SM monolayers and their mixtures with 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and cholesterol (Chol) (DOPC/SM/Chol 2:1:1). From the results we inferred that the cis double bond (Δ15) in 24:1-SM molecule diminishes intermolecular H-bonding and chain packing density compared to that of 16:0-SM. In ternary mixtures containing 16:0-SM, the relative intensity of the two components of the Amide I band reflected changes in the H-bonding network due to SM-Chol interactions. In contrast, the contribution of the main components of the Amide I band in DOPC/24:1-SM/Chol remained as in 24:1-SM monolayers, with a larger contribution of the non-H-bonded component. The most interesting feature in these ternary films is that the Cdouble bondO stretching mode of DOPC appeared with an intensity similar to that of SM Amide I band in DOPC/16:0-SM/Chol monolayers (a two-phase [Lo/Le] system), whereas an extremely low intensity of the Cdouble bondO band was detected in DOPC/24:1-SM/Chol monolayers (single Le phase). This is evidence that the unsaturation in 24:1-SM affected not only the conformational properties of acyl chains but also the orientation of the chemical groups at the air/water interface. The physical properties and overall H-bonding ability conferred by 24:1-SM may have implications in cell signaling and binding of biomolecules.Fil: Vázquez, Romina Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Departamento de Química; ArgentinaFil: Daza Millone, Maria Antonieta. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; ArgentinaFil: Pavinatto, Felippe J.. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Fanani, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Universidad Catolica de Córdoba. Facultad de Medicina. Departamento de Química Biologica; ArgentinaFil: Oliveira, Osvaldo N. Jr.. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Vela, Maria Elena. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Instituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicadas; ArgentinaFil: Maté, Sabina María. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner". Universidad Nacional de la Plata. Facultad de Ciencias Médicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner"; Argentin

Self-assembled nanostructures of L-ascorbic acid alkyl esters support monomeric amphotericin B

Amphotericin B (AmB) is a highly effective antimicrobial, with broad antimycotic and antiparasitic effect. However, AmB poor water-solubilisation and aggregation tendency limits its use for topical applications. We studied the capacity of nanostructures formed by alkyl esters of L-ascorbic acid (ASCn) to solubilise AmB and tested the relationship between the prevalence of the monomeric form of AmB and its effectiveness as antimicrobial agent.Fil: Nocelli, Natalia Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Río Cuarto. Facultad de Ciencias Exactas Fisicoquímicas y Naturales. Departamento de Biología Molecular; ArgentinaFil: Zulueta Díaz, Yenisleidy de Las Mercedes. Universidad Nacional de Córdoba; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; ArgentinaFil: Millot, Marine. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Colazo, María Luz. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; ArgentinaFil: Vico, Raquel Viviana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Instituto de Investigaciones en Físico-química de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Instituto de Investigaciones en Físico-química de Córdoba; ArgentinaFil: Fanani, Maria Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentin

Impact of sphingomyelin acyl chain (16:0 vs 24:1) on the interfacial properties of Langmuir monolayers: A PM-IRRAS study

Membrane structure is a key factor for the cell`s physiology, pathology, and therapy. Evaluating the importance of lipid species such as N-nervonoyl sphingomyelin (24:1-SM) -able to prevent phase separation- to membrane structuring remains a formidable challenge. This is the first report in which polarization-modulated infrared reflection-absorption spectroscopy (PM-IRRAS) is applied to investigate the lipid-lipid interactions in 16:0 vs 24:1-SM monolayers and their mixtures with 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and cholesterol (Chol) (DOPC/SM/Chol 2:1:1). From the results we inferred that the cis double bond (Δ15) in 24:1-SM molecule diminishes intermolecular H-bonding and chain packing density compared to that of 16:0-SM. In ternary mixtures containing 16:0-SM, the relative intensity of the two components of the Amide I band reflected changes in the H-bonding network due to SM-Chol interactions. In contrast, the contribution of the main components of the Amide I band in DOPC/24:1-SM/Chol remained as in 24:1-SM monolayers, with a larger contribution of the non-H-bonded component. The most interesting feature in these ternary films is that the CO stretching mode of DOPC appeared with an intensity similar to that of SM Amide I band in DOPC/16:0-SM/Chol monolayers (a two-phase [Lo/Le] system), whereas an extremely low intensity of the CO band was detected in DOPC/24:1-SM/Chol monolayers (single Le phase). This is evidence that the unsaturation in 24:1-SM affected not only the conformational properties of acyl chains but also the orientation of the chemical groups at the air/water interface. The physical properties and overall H-bonding ability conferred by 24:1-SM may have implications in cell signaling and binding of biomolecules.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y Aplicada

Boundary region between coexisting lipid phases as initial binding sites for Escherichia coli alpha-hemolysin: A real-time study

α-Hemolysin (HlyA) is a protein toxin, a member of the pore-forming Repeat in Toxin (RTX) family, secreted by some pathogenic strands of Escherichia coli. The mechanism of action of this toxin seems to involve three stages that ultimately lead to cell lysis: binding, insertion, and oligomerization of the toxin within the membrane. Since the influence of phase segregation on HlyA binding and insertion in lipid membranes is not clearly understood, we explored at the meso- and nanoscale - both in situ and in real-time - the interaction of HlyA with lipid monolayers and bilayers. Our results demonstrate that HlyA could insert into monolayers of dioleoylphosphatidylcholine/sphingomyelin/cholesterol (DOPC/16:0SM/Cho) and DOPC/24:1SM/Cho. The time course for HlyA insertion was similar in both lipidic mixtures. HlyA insertion into DOPC/16:0SM/Cho monolayers, visualized by Brewster-angle microscopy (BAM), suggest an integration of the toxin into both the liquid-ordered and liquid-expanded phases. Atomic-force-microscopy imaging reported that phase boundaries favor the initial binding of the toxin, whereas after a longer time period the HlyA becomes localized into the liquid-disordered (Ld) phases of supported planar bilayers composed of DOPC/16:0SM/Cho. Our AFM images, however, showed that the HlyA interaction does not appear to match the general strategy described for other invasive proteins. We discuss these results in terms of the mechanism of action of HlyA.Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La PlataInstituto de Investigaciones Fisicoquímicas Teóricas y AplicadasFacultad de Ciencias Exacta

Nanoemulsions of synthetic rhamnolipids act as plant resistance inducers without damaging plant tissues or affecting soil microbiota

Plant pathogens and pests can cause significant losses in crop yields, affecting food security and the global economy. Many traditional chemical pesticides are used to combat these organisms. This can lead to the development of pesticide-resistant strains of pathogens/insects and negatively impact the environment. The development of new bioprotectants, which are less harmful to the environment and less likely to lead to pesticide-resistance, appears as a sustainable strategy to increase plant immunity. Natural Rhamnolipids (RL-Nat) are a class of biosurfactants with bioprotectant properties that are produced by an opportunistic human pathogen bacterium. RL-Nat can act as plant resistance inducers against a wide variety of pathogens. Recently, a series of bioinspired synthetic mono-RLs produced by green chemistry were also reported as phytoprotectants. Here, we explored their capacity to generate novel colloidal systems that might be used to encapsulate bioactive hydrophobic compounds to enhance their performance as plant bioprotectants. The synthetic mono-RLs showed good surfactant properties and emulsification power providing stable nanoemulsions capable of acting as bio-carriers with good wettability. Synthetic RLs-stabilized nanoemulsions were more effective than RLs suspensions at inducing plant immunity, without causing deleterious effects. These nanoemulsions were innocuous to native substrate microbiota and beneficial soil-borne microbes, making them promising safe bio-carriers for crop protection

Modulación supramolecular de la actividad de esfingomielinasa en biointerfases

Tesis (Dr. en Ciencias Químicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2001.Fil: Fanani, María Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Fil: Fanani, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina.Las esfingomielinasas (Sphmasas) son enzimas que catalizan la hidrólisis de esfingomielina (Sphm) para formar ceramida (Cer) y fosfocolina que están implicadas en eventos de transducción de señales celulares. Al igual que otras fosfolipasas, su acción modifica la composición lipídica de la membrana donde actúa y puede conducir a alteraciones de las propiedades fisicoquímicas de las mismas. En este trabajo de tesis se estudió la acción de Sphmasa frente a monocapas lipídicas con el objetivo de dilucidar si los cambios de propiedades de la membrana donde actúa pueden influir sobre la actividad de otra vía metabólica (en este trabajo fosfolipasa A2) con la que no se comparten intermediarios lipídicos. Para ello se desarrolló una técnica que permite monitorear continuamente la actividad de Sphmasa frente a monocapas de sustrato puro o mezcla de lípidos, manteniendo la organización intermolecular del sustrato controlada. Nuestro estudio de la catálisis interfasial de B. cereus Sphmasa reveló la presencia de un período de latencia, llamado corrientemente "Lag Time", que es anterior a la etapa de catálisis que se desarrolla con velocidad constante. La actividad Sphmasa depende, de manera reversible, de la presión lateral y actúa mas favorablemente sobre el sustrato empaquetado mas laxamente (fase líquido expandida), mientras que lo degrada con dificultad a presiones laterales donde se encuentra en fase mas condensada. Se describió en detalle la cinética interfasial de Sphmasa de B. cereus. Se ensayaron seis modelos cinéticos para dilucidar posibles mecanismos de activación interfasial de la enzima durante el período de latencia. Se concluyó que la cinética de la reacción catalizada por Sphmasa en monocapas de Sphm pura es consistente con un mecanismo que involucra una partición inicial de la enzima a la interfase, un paso posterior que puede ser simulado operacionalmente como un proceso de dependencia bimolecular con la concentración bidimensional de la enzima, seguido de un paso irreversible de activación. La cinética de activación es cinco ordenes de magnitud más lenta que la de catálisis. Concluimos que el establecimiento de un equilibrio entre un 1 Resumen aparente estado monomolecular y bimolecular de la enzima en la interfase, acoplado a un proceso de activación lento, constituiría el paso limitante para explicar la existencia del Lag Time en la reacción catalizada por B. cereus Sphmasa. También se estudió la influencia mutua, a nivel de interfase, entre dos vías fosfohidrolíticas que actúan en biomembranas: las vías catalizadas por Sphmasa y fosfolipasa A2 (PLA2). Los productos y sustratos de una de estas vías fosfohidrolíticas tienen profunda y selectiva influencia sobre la actividad de la otra enzima cuando están presentes en la monocapa-sustrato a baja proporción molar (10%). Ésta modulación no está mediada por una interacción directa de los lípidos analizados con la enzima, sino que es un efecto que ocurre en la interfase. Estos resultados indicaron que la formación a nivel de membrana de productos derivados de una vía degradativa contiene información que es detectada y puede regular marcadamente la actividad de otra vía con la cual no posee intermediarios lipídicos comunes. Esto indica una "intercomunicación" entre ambas vías fosfohidrolíticas que es mediada por las propiedades interfasiales. Nuestras observaciones indican que la modulación cruzada por sustratos y productos de las actividades de Sphmasa y PLA2 es regulada diferencialmente por cambios en la presión de superficie alterando, al menos en dos niveles independientes (las etapas de preactivación interfasial y la de catálisis efectiva) la acción de la enzima asociada a la interfase. Nuestros resultados sugieren que a altas presiones de superficie se produciría un efecto de activación amplificado entre ambas vías fosfohidrolíticas. Este comportamiento cambia dramáticamente a bajas presiones donde la influencia simultanea de ambas vías fosfohidrolíticas puede conducir a una sinérgica disminución de las actividades de ambas enzimas, causando un silenciamiento cooperativo mutuo. Un aumento de la actividad Sphmasa o una disminución en la duración del período de Lag Time no es una consecuencia simple del estado de la interfase (líquido-expandido o líquido-condensado) por cuanto no se correlacionan directamente con interacciones específicas entre los lípidos pertenecientes a cada vía fosfohidrolítica. Sin embargo, se ha encontrado una correlación entre la existencia de dominios segregados lateralmente en monocapas lipídicas con la capacidad de favorecer las etapas precatalíticas (y disminuir el Lag Time) de la cinética de Sphmasa. La modulación interfasial de la acción de Sphmasa por lípidos no sustrato podría ser mediado por alteraciones en la organización global 2 Resumen de la interfase a mediana escala (alteración de la topografía, separación lateral de fases y formación de defectos laterales) mas que por cambios locales de interacciones específicas lípido-lípido. Otro aspecto del trabajo se dirigió a investigar si la formación enzimática de Cer en una interfase puede transmitir información a niveles supramoleculares que excedan el entorno molecular inmediato. Para ello estudiamos la posible variación de la topografía de monocapas monomoleculares de sustrato sometidas a la acción de Sphmasa en tiempo real y las comparamos con las de monocapas de similar composición lipídica, preparadas con proporciones conocidas de lípidos, utilizando la técnica de microscopía de epifluorescencia. Los resultados indican que Cer induce la formación de una fase condensada segregada lateralmente, que influye a un nivel mesoscópico sobre la topografía global de la monocapa. De esta forma se produce una transmisión de información entre eventos que ocurren a nivel de la catálisis enzimática local y fenómenos que ocurren al nivel supramolecular. La microscopía de epifluorescencia revela diferencias sustanciales en la topografía de superficie de monocapas de Sphm conteniendo Cer generada enzimáticamente o por premezcla de lípidos de composición comparable. Es decir que la topografía interfasial contiene información que depende marcadamente no sólo de las proporciones relativas de Sphm y Cer, sino de la manera en que los componentes lipídicos fueron generados. A su vez, los cambios topográficos que tienen lugar en la monocapa a lo largo de la reacción parecen ejercer influencia sobre la propia catálisis. La aparición de dominios segregados lateralmente coincide con el final del período del Lag Time y el momento en que la monocapa alcanza el umbral de percolación de la fase condensada coincide con el alejamiento de la cinética de reacción del régimen de pseudo cero orden. De esta forma, la degradación de Sphm y formación de Cer (eventos a escala molecular local) modifican la topografía global de la interfase (eventos a escala supramolecular) lo cual regula a su vez el comportamiento enzimátíco de Sphmasa (nuevamente a escala molecular). Es decir que existe una transferencia de información multidireccional entre eventos que ocurren a niveles de organización que difieren en órdenes de magnitud.Fil: Fanani, María Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina.Fil: Fanani, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina

Phospholipases and Membrane Curvature: What Is Happening at the Surface?

In this revision work, we emphasize the close relationship between the action of phospholipases and the modulation of membrane curvature and curvature stress resulting from this activity. The alteration of the tridimensional structure of membranes upon the action of phospholipases is analyzed based on studies on model lipid membranes. The transient unbalance of both compositional and physical membrane properties between the hemilayers upon phospholipase activity lead to curvature tension and the catalysis of several membrane-related processes. Several proteins’ membrane-bound and soluble forms are susceptible to regulation by the curvature stress induced by phospholipase action, which has important consequences in cell signaling. Additionally, the modulation of membrane fusion by phospholipase products regulates membrane dynamics in several cellular scenarios. We commented on vesicle fusion in the Golgi-endoplasmic system, synaptic vesicle fusion to the plasma membrane, viral membrane fusion to host cell plasma membrane and gametes membrane fusion upon acrosomal reaction. Furthermore, we explored the modulation of membrane fusion by the asymmetric adsorption of amphiphilic drugs. A deep understanding of the relevance of lipid membrane structure, particularly membrane curvature and curvature stress, on different cellular events leads to the challenge of its regulation, which may become a powerful tool for pharmacological therapy