Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži, u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj proizvodnji

Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži, u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj proizvodnji

Improving rainfall nowcasting and urban runoff forecasting through dynamic radar-raingauge rainfall adjustment

The insufficient accuracy of radar rainfall estimates is a major source of uncertainty in short-term quantitative precipitation forecasts (QPFs) and associated urban flood forecasts. This study looks at the possibility of improving QPFs and urban runoff forecasts through the dynamic adjustment of radar rainfall estimates based on raingauge measurements. Two commonly used techniques (Kriging with External Drift (KED) and mean field bias correction) were used to adjust radar rainfall estimates for a large area of the UK (250,000 km2) based on raingauge data. QPFs were produced using original radar and adjusted rainfall estimates as input to a nowcasting algorithm. Runoff forecasts were generated by feeding the different QPFs into the storm water drainage model of an urban catchment in London. The performance of the adjusted precipitation estimates and the associated forecasts was tested using local rainfall and flow records. The results show that adjustments done at too large scales cannot provide tangible improvements in rainfall estimates and associated QPFs and runoff forecasts at small scales, such as those of urban catchments. Moreover, the results suggest that the KED adjusted rainfall estimates may be unsuitable for generating QPFs, as this method damages the continuity of spatial structures between consecutive rainfall fields

Mikrobiota spontano fermentiranih kobasica od mesa divljači

In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However, high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb. curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw). Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01) and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus (WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13) were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures. Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L. monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda, potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura. Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju. Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105). Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK (28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus (11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %) i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju. Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 % kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu (Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i 7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS), što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei (40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost) kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19 bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 % pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između 203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57) u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za 4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1) pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani, budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina. Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost, svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34 og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži, u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj proizvodnji

Autohtoni sojevi roda Lactobacillus izolirani iz Istarskog sira kao potencijalne starter kulture

Istrian ewe’s milk cheese is an autochthonous product that is manufactured for generations on small family farms in the Croatian peninsula Istria. Traditional Istrian cheese is made from unpasteurized ewe’s milk, without the addition of starter cultures. Consequently, the specific flavour and texture of the Istrian cheese is owed to metabolic processes of indigenous microflora of which Lactobacillus species play pivotal role. Characterisation and selection of indigenous lactobacilli may result in the potential use of selected strains as starter, bioprotective or even probiotic cultures. This study focuses on potential use of Lactobacillus plantarum and Lactobacillus casei isolated from traditional Istrian cheese as starter cultures, by using methods that determine their proteolytic, lipolytic, antimicrobial and haemolytic potential, as well as their ability of acidification, autoaggregation and survival in simulated gastrointestinal conditions. Our results indicated that from 12 representative strains most revealed a low or moderate proteolytic activity as well as absence of lipolytic and haemolytic activities. From 12 strains, 5 of them showed a medium to strong acidification ability and lowered the pH of milk below 5.00 after 24 hours of incubation. Furthermore, almost all isolates exhibited antimicrobial activity against Serratia marcescens, and lowest number of isolates showed antimicrobial activity against Staphylococcus aureus and Listeria innocua. The studied Lactobacillus strains revealed high survival rate in a simulated oral cavity and duodenum conditions, while the survival ability in a simulated gastric conditions was much lower. Ability to aggregate was low for all tested strains, after 3 hours and after 5 hours of incubation.Tradicionalni Istarski sir proizvodi se od nepasteriziranog ovčjeg mlijeka, bez dodatka starter kultura. Prema tome, specifična aroma i tekstura Istarskog sira pripisuje se, uz ostale faktore, metaboličkim procesima autohtone mikroflore od kojih vrste roda Lactobacillus imaju ključnu ulogu. Karakterizacija i izbor autohtonih sojeva laktobacila može dovesti do potencijalnog korištenje odabranih sojeva kao starter, zaštitnih ili probiotičkih kultura. U ovom istraživanju željeli smo istražiti tehnološki i probiotički potencijal sojeva Lactobacillus plantarum i Lactobacillus casei izoliranih iz tradicionalnog Istarskog sira pomoću metoda koje određuju njihov proteolitički, kazeinolitički, lipolitički, antimikrobni i hemolitički potencijal, kao i njihovu sposobnost zakiseljavanja, autoagregacije i preživljavanja u simuliranim gastrointestinalnim uvjetima. Svih 12 reprezentativnih sojeva pokazuju nisku do umjerenu proteolitičku aktivnost te odsutnost lipolitičke i hemolitičke aktivnosti. Od 12 sojeva, 5 je pokazalo jaku sposobnost zakiseljavanja, spuštajući pH mlijeka ispod 5,00 nakon 24 sati inkubacije. Nadalje, gotovo svi izolati pokazuju antimikrobno djelovanje u odnosu na vrstu Serratia marcescens te slabo antimikrobno djelovanje u odnosu na Staphylococcus aureus i Listeria innocua. Istraživani sojevi pokazali su visoku prosječnu stopu preživljavanja u simuliranim uvjetima usne šupljine i dvanaesnika, dok je prosječna stopa preživljavanja u simuliranim želučanim uvjetima bila znatno niža. Nakon 5 sati inkubacije, autoagregacijska sposobnost svih istraživanih sojeva bila je niska

Processing of Data Obtained by the Testing of Steel under Low Cyclic Fatigue (Part I)

The design of mechanical components exposed to fatigue load, at a low number of cycles, requires knowledge of the behaviour of the material under the impact of variable load in conditions of controlled strain when cyclic plasticity is present. The aim of testing the quality of the material of the components exposed to low cycle fatigue (LCF) in many industries: nuclear, aerospace, mechanical, civil engineering and shipbuilding. In order to ensure the reliability and consistency of the results from different laboratories, it is necessary to collect all test data using test and data processing methodologies that are in accordance with a number of key points of ISO 12106:2017 and/or ASTM E 606-04 standards. This paper defines a new data processing methodology after the LCF testing of steel

Transient expression in tobacco Bright Yellow 2 cells and pollen grains: A fast, efficient and reliable system for functional promoter analysis of plant genes

Ekspresija gena je regulisana posredstvom promotora-DNK sekvenci uzvodno od kodirajućeg regiona. Promotori svojom sekvencom određuju mesta vezivanja transkripcionih faktora, regulatora i RNK polimeraze. Strukturna i funkcionalna analiza promotora neophodna je za razumevanje mehanizama genske ekspresije. Cilj ovog rada je razvijanje brzog, efikasnog i pouzdanog sistema za testiranje bazalne promotorske aktivnosti kao i otkrivanje sekvenci polen-specifičnih elemenata promotora. U ovom radu je testirana funkcionalnost promotora za metalotionein heljde, posredstvom histohemijskog GUS-eseja u dva tranzijentna sistema za ekspresiju: BY2 ćelijama i polenovim zrnima. U oba sistema je uočena izražena aktivnost ispitivanog promotora.Gene expression is mediated by DNA sequences directly upstream from the coding sequences, recruited transcription factors and RNA polymerase in a spatially-defined manner. Understanding promoter strength and regulation would enhance our understanding of gene expression. The goal of this study was to develop a fast, efficient and reliable method for testing basal promoter activity and identifying core sequences within its pollen specific elements. In this paper we examined the functionality of buckwheat metallothionein promoter by a histochemical GUS assay in two transient expression systems: BY2 cells and pollen grains. Strong promoter activity was observed in both systems

Efekat Ni na koncentraciju najzastupljenijih esencijalnih katjona u nekim vrstama iz roda Brassica

Some plants from the genus Brassica have the ability to tolerate excessive concentrations of heavy metals, including Ni. Considering the fact that Ni is a very toxic element for living beings we wanted to examine its influence on some species from genus Brassicaceae. The aim of this study was to investigate the effect of Ni on distribution and accumulation of essential macronutrients from the standpoint of food quality and phytoremediation potential. Experiments were performed using winter (W) and spring (S) varieties of rapeseed (Brassica napus, L.), white mustard (Brassica alba, L.), black mustard (Brassica nigra, L.) and turnip (Brassica rapa, L.). The seeds were exposed to 10 µM Ni from the beginning of germination. Plants were grown in water cultures, in semi-controlled conditions of a greenhouse, on ½ strength Hoagland solution to which was added Ni in the same concentration as during germination. Concentrations and distribution of Ca, Mg, K in leaf and stem were altered in the presence of increased concentration of Ni. Significant differences were found between the control and Ni-treated plants as well as among the genotypes.Neke biljke iz roda Brassica imaju sposobnost tolerancije prekomerne koncentracije teških metala, uključujući i nikal (Ni). Ispitivanje efikasnosti apsorpcije i akumulacije teških metala interesantno je sa stanovišta: 1) bezbednosti hrane, i 2) potencijala za fitoremedijaciju. Cilj ovog rada je da se ispita efekat nikla na distribuciju i akumulaciju nekih esencijalnih katjona kao što su kalcijum (Ca), magnezijum (Mg) i kalijum (K). Eksperimenti su izvedeni nad ozimom i jarom uljanom repicom (Brassica napus L.), belom slačicom (Brassica alba, L.), crnom slačicom (Brassica nigra L.) i kupusnom uljanom repicom (Brassica rapa L.). Seme je bilo izloženo uticaju 10 µM nikla (Ni) od početka klijanja. Biljke su gajene u vodenim kulturama, u polukontrolisanim uslovima u stakleniku, na ½ Hogland-ovom hranljivom rastvoru, odnosno potpunom hranljivom rastvoru u koji je dodat nikal (Ni) u istoj koncentraciji kao i tokom klijanja. Sadržaj kalcijuma (Ca), magnezijuma (Mg) i kalijuma (K) u listu i stablu izmenjen je u prisustvu povećane koncentracije nikla (Ni). Značajne razlike ustanovljene su kako između kontrole i tretmana, tako i između genotipova. Svi testirani genotipovi ispoljili su značajnu sposobnost akumulacije nikla (Ni), s tim što je Brassica napus jara forma imala najveće razlike u koncentraciji u odnosu na kontrolu (u listu 67,75 puta, a u stablu 92,5)

Effects of Alloying Elements on the Properties of HSLA Steel

The first industrial application of elevated and high-strength steel in the form of hot-rolled strips and sheets was the manufacture of pipes and vessels under pressure, as it was possible to reduce the thickness, i.e. to reduce the weightof welded structures. The high-strength low-alloy steels used today are usually obtained by suitable chemical composition and thermomechanical treatment. Our investigated steel NIOMOL 490 K belongs to the class of molybdenum microalloyed steels, where the microalloying with molybdenum serves to increase the heat resistance of the steel and at the same time strengthen the influence of other alloying elements. This steel grade is designed for the manufacture of welded pressure vessels fabrication and is mainly used for dynamic loading conditions at low operating temperatures. In the present paper, the tensile and hardness tests were used to determine the effects of alloying elements on the mechanical properties of NIOMOL 490K steel in the temperature range from -60°C to +60°C