In the present study, the microbiota of three wild boar (WB1, WB2, WB3) and three deer
meat (DS1, DS2, DS3) sausage types was characterised, with focus on lactic acid
bacteria. The sausage samples were collected in triplicates (n=105) from each of the
sausage producers at day zero (0), after 4, 7, 10, 20 days and at the end of the ripening
period (20 or 40 days). Dominant LAB isolates collected from sausages were identified as
Le. mesenteroides (n=259), Lb. sakei (n=190) and E. casseliflavus (n=106). However,
high throughput amplicon sequencing revealed lactobacilli, mainly Lb. sakei and Lb.
curvatus, as the predominant species, with 20.55 % of sequences at the beginning of
fermentation and 70.48 % in mature sausages. It seems that the isolation of LAB on
selective media favored the growth of Le. mesenteroides, since its predominance was
also observed in the denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) analysis of bulk
colonies collected from De Man, Rogosa and Sharpe agar (MRS) plates, indicating
insufficient selectivity of the used media. On the other hand, HTS can also be biased due
to DNA isolation (cell lysis) and polymerase chain reaction (PCR) analysis, which can
favour certain microbial population. Regarding bacterial diversity during sausage
production, the number of operational taxonomic units (OTUs) was highest at day 0 and
day 4, followed by a decrease toward the later phases of fermentation and ripening, which
might be explained by the decrease of pH and available water for microbial growth (aw).
Measured alpha diversity parameters (Shannon's index and Pielou evenness) were
significantly higher in wild boar meat sausages compared to deer meat at day 4 (p<0.01)
and day 7 (p<0.05), which might be linked to a different lifestyles, type of diet and feeding
habits of wild boar and deer. With fermentation time, the abundance of undesired and
potentially harmful microbiota decreased indicating the microbial stability and safety of
final products. However, 33 % of ready-to-eat sausages can be considered as
inappropriate for human consumption, due to the elevated cell counts of
Enterobacteriaceae (DS2, WB3) as well as E. coli, coliforms and presumptive B. cereus
(WB3). To select strains suitable to be used as indigenous starter cultures, 1326 LAB
isolates were collected from sausages. Isolates were grouped based on their rep-PCR
patterns, and 57 representatives were selected and screened for safety issues and
technological potential, as well as probiotic potential. Around half of the tested
representatives (56.14 %) was safe for application in food, of which 53.12 % showed good
acidification activity (pH<4) and variable other technological traits. Based on the results of
safety and technological characterization, 2 Lb. sakei strains (MRS_296 and C_7d_13)
were selected and applied simultaneously in meat batter as indigenous starter cultures.
Although respective strains were originally grouped in the same cluster, they exhibited
different technological traits. The majority (86.49 %) of isolates recovered from inoculated
batch had rep-PCR patterns that corresponded to the patterns of respective starter
cultures, suggesting that applied strains were able to establish themselves from day zero
and prevailed through the production. However, considering that rep-PCR patterns of
MRS_296 and C_7d_13 were not possible to differentiate, it is not possible to say whether
both strains survived, or only a single one, and if, which one. It seems that the inoculation
of native starter cultures suppressed the growth of Enterobacteriaceae, coliforms and L.
monocyogenes. The pH values were significantly lower throughout the production in the
inoculated batch (p<0.05) than in control. The tyramine content was 67.18 % lower in the
ready-to-eat inoculated batch compared to the control. Such results suggest the efficiency
of applied starter cultures as well as highlighting their potential of its use in future.Trajne, spontano fermentirane kobasice od mesa divljači se proizvode na malim
obiteljskim gospodarstvima, prateći tradicionalne recepture i postupke. Zbog toga su
prepoznate i cijenjene kao autohtoni, odnosno, tradicionalni proizvodi specifičnih
senzornih osobina. Međutim, budući da se proizvode bez upotrebe starter kultura i to
često u varijabilnim uvjetima, fermentacija ovisi o metaboličkoj aktivnosti prirodno prisutnih
populacija bakterija mliječne kiseline (BMK) te stoga mikrobiološka sigurnost krajnjeg
proizvoda može biti kompromitirana. Također, na mikrobiološku (zdravstvenu) sigurnost
gotovih kobasica od mesa divljači utječu mnogi faktori povezani s načinom odstrijela
divljači i daljnje obrade mesa. Da bi se osigurala potrebna kvaliteta gotovih proizvoda,
potrebno je u potpunosti kontrolirati čitav proizvodni proces, a jedan od načina je upotreba
detaljno karakteriziranih starter kultura u njihovoj proizvodnji. Budući da komercijalne
starter kulture nisu jednako efikasne u svim tipovima proizvoda, tendencija je aplikacija
autohtonih startera, a upravo spontano fermentirani proizvodi koji nisu termički obrađeni
predstavljaju izvor velikog broja različitih bakterijskih sojeva, naročito BMK. Dok je
mikrobiota mnogih drugih tradicionalnih fermentiranih proizvoda detaljno istražena i
karakterizirana, dostupna literatura o takvim saznanjima o kobasicama od mesa divljači je
vrlo limitirana. Stoga je prvi korak ovog istraživanja bio karakterizirati prirodno prisutnu
mikrobiotu ovakvih kobasica, te nakon toga prikupiti i detaljno karakterizirati sojeve BMK s
ciljem selekcije onih bakterijskih sojeva prikladnih za daljnje korištenje kao starter kultura.
Mikrobna raznolikost tri tipa kobasica od mesa divlje svinja (WB1, WB2, WB3) i tri od
mesa jelena (DS1, DS2, DS3) je istražena koristeći metode ovisne i neovisne o uzgoju.
Uzorci kobasica su prikupljeni u triplikatima tijekom različitih faza proizvodnje (n=105).
Izdvajanjem BMK na selektivnim mikrobiološkim medijima tijekom različitih faza zrenja I
fermentacije (0, 4, 7, 10, 20 ili/i 40 dana) te molekularno-biološkom identifikacijom
prikupljenih izolata, Leuconostoc mesenteroides je prepoznat kao dominanta vrsta BMK
(28,24 %), a sljedili su ga Lactobacillus sakei (20,72 %) i Enterococcus casseliflavus
(11,55 %). Le. mesenteroides je izoliran i identificiran u velikoj mjeri na LamVab (52,31 %)
i De Man, Rogosa i Sharpe agaru (MRS) (40,89 %) mikrobiološkim podlogama, od kojih
se naročito LamVab smatra selektivnima za laktobacile, što upućuje na zaključak da su
navedeni mediji favorizirali rast leukonostoka. Ovaj zaključak podupiru rezultati analize
DNA u denaturirajućem gradijentnom gelu poliakrilamida (DGGE) konzorcija prikupljenih
sa MRS medija, budući da su potvrdili dominaciju Le. mesenteroides na ovom mediju.
Osim za izdvajanje i prikupljanje BMK, različiti selektivni mediji su korišteni za detekciju i
određivanje vijabilnog broja (cfu/g) ostalih ciljanih mikrobnih skupina, uključujući
mikrobiotu kvarenja i potecijalne patogene. Ovakav je pristup omogućio procjenu
mikrobiološke ispravnosti gotovih kobasica, budući da su propisani referentni intervali
temeljeni na uzgoju i određivanju broja naraslih kolonija. Utvrđeno je da ukupno 33,33 %
kobasica predstavljaju rizik za konzumaciju zbog povećanog broja bakterija porodice
Enterobacteriaceae (DS2, WB3), kao i E. coli, koliformnih bakterija i hemolitičkih bakterija
iz grupe B. cereus (WB3). S druge strane, analizom podataka dobivenih sekvenciranjem
sljedeće generacije (engl. next generation sequencing; NGS) koristeći Miseq platformu
(Illumina), dobivena je šira slika o zastupljenosti različitih mikobnih zajednica, budući da je
izdvojena i analizirana ukupna bakterijska DNA prisutna u kobasicama, dakle, analiza nije
ograničena samo na ciljane mikrobne skupine. Općenito, najveća mikrobna raznolikost je
zabilježena u samom početku proizvodnje kobasica (0. i 4. dan) nakon čega opada prema
kasnijim fazama fermentacije i zrenja. Zabilježeni pad raznolikosti se može objasniti kao
rezultat pada pH vrijednosti, smanjenja dostupne vode za rast bakterija (aw) i
antagonizmom prirodno prisutnih BMK. Iako je općenito raznolikost ostala ujednačena kod
oba tipa kobasica kada su uspoređeni isti vremenski intervali, Shannonov index i
ujednačenost po Pielou su ukazali na veću razinu raznolikosti bakterijskih populacija u 4. i
7. danu kod kobasica od mesa divlje svinje (WB) nego kod kobasica od mesa jelena (DS),
što je vjerojatno povezano s različitim načinom života i prehrane ovih životinja. Zajedno s
trendom pada ukupne bakterijske raznolikosti tijekom fermentacije i zrenja, zabilježen je i
pad neželjenih mikroorganizama, s iznimkom bakterija iz roda Stenotrophomonas i
Pseudomonas čiji pad nije zabilježen. Ova je metodologija također omogućila detaljniji
uvid u strukturu prisutnih zajednica BMK, pri čemu su primijećena neslaganja s
rezultatima dobivenima klasičnim metodama (ovisnima o uzgoju). Analizom NGS
podataka vrste roda Lactobacillus su identificirane kao dominantne, i to vrste Lb. sakei
(40,32 %), Lb. curvatus (40,29 %) i Lb. plantarum (1,31 %), dok su ostale BMK
detektirane u malom broju. Iako se sekvenciranje sljedeće generacije pokazalo kao
pouzdan pristup za in situ karakterizaciju mikrobiote prisutne u trajnim kobasicama od
divljači, izolacija i prikupljanje BMK na selektivnim podlogama je nužna za prikupljanje
kolekcije vijabilnih sojeva. U ovom istraživanju je prikupljeno ukupno 917 izolata na
mikrobiološkim medijima selektivnima za BMK. Međutim, BMK su također prikupljene i iz
drugih trajnih tradicionalnih kobasica od mesa divlje svinje i jelena te su uključene u ovo
istraživanje, tako da je ukupno prikupljeno 1326 izolata. Svi izolati su identificirani koristeći
molekularno-biološke metode (rod i vrsta specifični PCR, sekvenciranje po Sangeru) te su
genotipizirani pomoću rep-PCR metode koristeći GTG5 početnicu. Obrasci dobiveni repPCR
metodom su pokazali visoku razlučivost između sojeva i omogućili njihovo
grupiranje. Izabrano je 57 reprezentativnih sojeva koji su uključeni u daljnje analize s
ciljem selekcije odgovarajućih starter kultura. Prvenstveno, istražena je sigurnost njihove
upotrebe u hrani (rezistencija na antibiotike, prisutstvo gena koji kodiraju za biogene
amine i virulente faktore, hemolitička aktivnost) te su istražene njihove tehnološke
karakteristike (sposobnost brze acidifikacije, lipolitička, proteolitička i peptidazna aktivnost)
kao i antimikrobna aktivnost. Među reprezentativnim predstavnicima, izabrano je 19
bakterijskih sojeva za koje je istražena sposobnost preživljavanja u simuliranim uvjetima
gastrointestinalnog (GI) trakta. Rezultati su pokazali da je približno polovica
reprezentativnih predstavnika (56,14 %) sigurna za primjenu u hrani, od kojih je 53,12 %
pokazalo dobru sposobnost acidifikacije, odnosno, snizili su pH mesnog medija s početnih
pH=5.8 na pH< 4 nakon 24 sata inkubacije. Velika većina reprezentativnih predstavnika
koji su smatrani sigurnima je pokazala lipoličku (96.87 %) i proteolitičku aktivnost na
mediju s obranim mlijekom (93.75 %), međutim samo je njih 9.37 % pokazalo sposobnost
razgradnje sarkoplazmatskih proteina. Njihova je peptidazna aktivnost varirala između
203.50±0.00 i 5942.20±0.14 µM pNA. Iako je većina reprezentativnih predstavnika (n=57)
u vijabilnom obliku pokazala antagonističku (antimikrobnu) aktivnost prema testiranim
indikatorskim bakterijama, kada je testiranje provedeno korištenjem njihovih neutraliziranih
supernatanata (slobodnih od bakterijskih stanica), antimikrobna aktivnost je zabilježena za
4 soja i to prema Listeria innocua ATCC 33090. Ovakav rezultat indicira da spomenuti
sojevi mogu imati sposobnost produkcije bakteriocina. Jedan je soj (E. durans A_4d_1)
pokazao sposobnost preživljavanja u simuliranih uvjetima GI trakta, naročito u uvjetima
tankog crijeva koji su bili pogubni za ostale sojeve, zbog čega se može smatrati
potencijalnim probiotičkim sojem. Temeljem rezultata sigurnosne i tehnološke
karakterizacije, 2 soja Lb. sakei (MRS_296 and C_7d_13) su odabrana za primjenu u
kobasicama kao starter kulture. Ovi sojevi se smatraju sigurnima za primjenu u hrani,
budući da nisu bili hemolitički aktivni, nisu pokazali rezistenciju prema testiranim
antibioticima te nije detektirano prisutstvo gena koji kodiraju za produkciju biogenih amina.
Iako su ova dva soja originalno bila grupirana u isti klaster, pokazali su različite tehnološke
karakteristike. MRS_296 je pokazao brzu sposobnost acidifikacije mesnog supstrata, što
je najvažniji preduvjet svake starter kulture. Iako niti jedan od izabranih sojeva nije
pokazao sposobnost razgradnje sarkoplazmatskih proteina, kod MRS_296 je detektirana
proteolitička aktivnost na mediju s obranim mlijekom. Soj C_7d_13, nije pokazao dobru
sposobnost acidifikacije, ali je pokazao zadovoljavajuću lipolitičku i peptidaznu aktivnost,
svojstva koja su nedostajala kod MRS_296. Oba soja su pokazala antimikrobno
djelovanje prema velikom broju testiranih bakterija. Izabrane autohtone starter kulture su
dodane u mesnu smjesu za pripremu kobasica (15 kg) s brojem vijabilnih stanica od 9,34
og cfu/g (MRS_296) i 9,30 log cfu/g (C_7d_13) dok je neinokulirana smjesa služila kao
kontrola. Kako bi se pratilo preživljavanje dodanih startera u kobasicama, izolati su
izdvojeni na medijima selektivnima za BMK, prikupljeni i genotipizirani pomoću rep-PCR
reakcije. Rep-PCR metodom je bilo moguće usporediti obrasce dodanih startera s
obrascima prikupljenih sojeva, odnosno, bilo je moguće na ovaj način pratiti preživljavanje
starter kultura. Velika većina sojeva (86,49 %) izoliranih iz kobasica s dodanim starterima
je imala rep-PCR obrasce koji odgovaraju obrascima dodanih startera, što pokazuje da su
dodani starteri preživjeli tijekom čitavog procesa proizvodnje kobasica. Međutim, budući
da nije moguće razlikovati rep-PCR obrasce između MRS_296 i C_7d_13, nije moguće
zaključiti da li su oba soja preživjela. Rezultati potpune mikrobiološke analize ukazuju na
efikasnost primjenjenih starter kultura, odnosno, pokazuju da je primjenom startera
kontroliran rast enterobakterija, koliformnih bakterija i L. monocyogenes kod inokulirane
grupe (šarže), u kojoj su pH vrijednost i koncentracija tiramina bili značajno (p<0,05) niži,
u odnosu na neinokuliranu kontrolu. Ovo istraživanje pruža uvid u in situ raznolikost i
brojnost prirodno prisutnih mikrobnih populacija kobasica od mesa divljači, što doprinosi
kompletnijem razumijevanju sastava i dinamike mikroorganizama kod ovakvog tipa
proizvoda. Kao jedan od ključnih koraka za NGS, optimizirana je izolacija DNA iz uzoraka
kobasica te je etablirana zbirka definiranih sojeva koji imaju potencijal za buduću uporabu
kao starter i/ili bioprotektivne kulture. Također, kroz ovo istraživanje dobivena je efikasna
starter kultura koja se sastoji od dva autohtona soja Lb. sakei, a koja se može primijeniti
za proizvodnju visoko kvalitetnih kobasica od mesa divljači u tradicionalnoj ili industrijskoj
proizvodnji
