Synthesis of New Series of 2-C-(β-D-glucopyranosyl)-Pyrimidines and Their Evaluation as Inhibitors of Some Glycoenzymes

L

A természet szénhidrátkémikusai: enzimatikus glikozilezések = Nature's carbohydrate chemists: enzymatic glycosylation

Oligoszacharidok enzimekkel történő előállítása egy igen vonzó alternatív módszer a konvencionális kémiai megközelítés mellett, mert védő csoportok használata nélkül a célvegyület képződését eredményezi. Ezen pályázatban az anomer konfigurációt megtartó alpha amilázok transzglikozilezési képességét tanulmányoztuk humán amiláz szubsztrátok és inhibitorok előállítására. Az akarviozinil-izomaltozil- spiro-tiohidantoin szintézisét a Bacillus stearothermophilus maltogén amilázával (BSMA) oldottuk meg. A BSMA enzim az akarbóz pszeudotriszacharid részét a glüko-spiro-tiohodantoin (GTH) akceptorra transzferálta. A PTS-GTH szerkezetvizsgálata azt mutatta, hogy a glikozilezés főként a glükóz 6-os OH-ján történt az anomer konfiguráció megtartásával. Az akarbózzal meghoszabbított termék több nagyságrenddel hatékonyabb inhibitora a humán amiláznak, mint a kis méretű GTH molekula. A humán amiláz nem rendelkezik transzferáz aktivitással, de mutációval sikerült transzglikozilezési képességet ?bevezetni? a vad típusú enzimbe. A Tyr151Met mutánssal kromoforral jelzett maltooligoszacharidokat állítottunk elő és a PNP 1-tio-béta-maltooligoszacharidokat DP 2-4 izoláltuk. A Tyr151Met mutáns maltotetraóz donorról maltóz és maltotrióz egységeket transzferált különböző PNP glikozidokra. Az NMR analízisek szerint a mutáns enzim megőrízte sztereo-és regioszelektivitását. A glikozilezés a glikozil akceptor 4-es OH-ján történt.Jelenleg árpa amiláz mutánsokkal történő szintézisek folynak. | Enzyme-catalyzed synthesis of oligosaccharides allows the formation of well-defined oligosaccharides selectively without using any protection of hydroxyl groups. In this project the application of transglycosylation ability of retaining glycosidases was studied for the synthesis of oligosaccharide substrates and inhibitors of human amylases. Synthesis of acarviosinyl-isomaltosyl-spiro-thiohydantoin has been achieved by Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA). BSMA was capable of transferring the acarviosine-glucose residue from an acarbose donor onto glucopyranosylidene-spiro-thiohydantoin (GTH). Structural studies revealed that the enzyme reserved its stereoselectivity. Glycosylation took place mainly at C-6 position. The isolated compound was found to be a much more efficient salivary amylase inhibitor than GTH with kinetic constants of KEI=0.19 uM and KESI= 0.24 uM. Transglycosylation activity has been introduced into human salivary alpha amylase by genetic engineering. Synthesis of PNP 1-thio beta-maltooligosaccharides DP 2-4 has been carried out by a Tyr151Met mutant of HSA. Tyr151Met was capable of transferring maltose and maltotriose residues from a maltotetraose donor onto different PNP glycosides. NMR studies revealed that the mutated enzyme preserved the stereo- and regioselectivity. The glycosylation took place at position 4 of the glycosyl acceptor, exclusively. Nowadays transferase activity of barley amylase mutants has also been studied

Mapping of barley α-amylases and outer subsite mutants reveals dynamic high-affinity subsites and barriers in the long substrate binding cleft

AbstractSubsite affinity maps of long substrate binding clefts in barley α-amylases, obtained using a series of maltooligosaccharides of degree of polymerization of 3–12, revealed unfavorable binding energies at the internal subsites −3 and −5 and at subsites −8 and +3/+4 defining these subsites as binding barriers. Barley α-amylase 1 mutants Y105A and T212Y at subsite −6 and +4 resulted in release or anchoring of bound substrate, thus modifying the affinities of other high-affinity subsites (−2 and +2) and barriers. The double mutant Y105A-T212Y displayed a hybrid subsite affinity profile, converting barriers to binding areas. These findings highlight the dynamic binding energy distribution and the versatility of long maltooligosaccharide derivatives in mapping extended binding clefts in α-amylases

Új HPLC eljárás az alfa-amiláz aktivitás és gátlás mérésére

The control of the hyperglycemia is crucial in the treatment of type II diabetes and other metabolic syndromes. In these situations, the α-amylases could play an important role in the increasing of the blood glucose level due the breakdown of the polysaccharides. The αamylases are the first enzymes, which take a part in the process of the releasing glucose monomers from complex polysaccharides. Therefore, the investigations of both α-amylase activities and the quantity of their inhibition are important on the field of anti-diabetic drug research. Our presented research was aimed to develop a new HPLC based method for the measurement of reaction product of α-amylase reaction using specially synthetized, pnitrophenyl-labelled maltooligomer substrate. After the enzyme reaction, three product was detectable possessing the chromophore-group during the reversed-phase separation. One of them was selected to follow the enzyme kinetic of the human salivary amylase applying linear regression on the area data acquired at different time points of the reaction. Furthermore, due to the specific substrate measuring only the α-amylase activity, our method could be used successfully also for the accurate measurement in the inhibition studies

Inhibition studies on α-amylase using isothermal titration calorimetry

L

Kutatások a MALDI-TOF tömegspektrometria szénhidrátkémia alkalmazási lehetőségeinek kiszélesítésére = Investigation of widening of the MALDI-TOF MS applications in carbohydrate chemistry

A kutatás fő célkitűzése volt szénhidrátok és származékaik (védőcsoportokat tartalmazó vagy fehérjéhez kötött oligoszacharidok) MALDI-TOF tömegspektrometriás meghatározásához optimális kísérleti körülmények megállapítása és így a szénhidrátkémiai kutatások segítése. Ciklodextrin modellvegyületek alkalmazásával vizsgáltuk a minta előkészítés és felvitel valamint a kísérleti paraméterek változtatásának hatását a spektrumra. Tanulmányozzuk a mátrix anyagának, a minta koncentrációjának, a mintafelvitel módjának és a reflektron detektor érzékenység hatását a spektrum minőségére. Védőcsoportokat tartalmazó oligoszacharidok mérésekor számos törvényszerűséget figyeltünk meg a védőcsoportok stabilitása, a különböző mátrixok és kísérleti paraméterek között. A MALDI mérések segítették a termékek és melléktermékek azonosítását kémiai és enzimes oligoszacharid szintézisek esetében. Fragmentációs vizsgálatokkal kémiai és enzimatikus szintézissel előállított oligoszacharidok, valamint természetes eredetű amiláz inhibítorok szerkezet felderítését végeztük el. Meghatároztuk különböző neoglikoproteinek oligoszacharid tartalmát, amely meghatározó a sikeres immunválasz kiváltásában. Méréseinkkel támogattuk a különböző neoglikoprotein előállítási módszerek szisztematikus vizsgálatát. | The object of this research program was the application of MALDI-TOF MS in the field of carbohydrates and glycoconjugates. Cyclodextrins as model compounds were used to investigate the effect of the sample preparation methods and experimental parameters on the spectrum. The studied experimental parameters were: different matrix compounds, detector sensitivity, sample concentration and sample preparation methods. The stability of the protecting groups under the conditions of the evaporation/ionization was studied. The MALDI measurements assisted to identify products and byproducts of different chemical and enzymatic oligosaccharide syntheses (eg. sugar-sulfonates, sulfonic acid esters, PNP-glycosides and acarbose derivatives). Structural analysis and verification were made using post source decay fragmentation method in case of a tetrasaccharid component of N-glycanes, acarbose and its derivatives obtained by enzymatic synthesis and some natural alpha-amylase inhibitors. In addition we used this method for determination of molecular masses of neoglycoproteins