Molecular diagnosis of American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) in dogs from an endemic area in Pernambuco State, Brazil

A survey was carried out to detect American cutaneous leishmaniasis (ACL) among dogs in an area where a human outbreak had occurred in the state of Pernambuco, in northeastern Brazil. Domiciled dogs living in the district of Três Ladeiras, Igarassu were used in the present study. The following procedures were performed: The Polymerase Chain Reaction (PCR) (n = 126); the Immunofluorescence Antibody Test (IFAT) (n = 80); and a parasitological examination to detect amastigote forms of Leishmania sp. in skin lesions (n = 43). Associations between the infection in animals and the clinical and epidemiological factors were analyzed using Fisher's exact test or the Pearson’s chi-squared test. In total, 46.8% (59/126) of the samples tested were PCRpositive. Although a higher frequency of positivity was detected among males (46.3 %) and animals aged between 3 and 4 years (50.0 %), no significant associations were recorded for these variables (p> 0.05). Similarly, the clinical signs and aspects related to the environment in which the animal lives did not differ significantly, but differences were recorded for the variable locality. In the IFAT, only 6.2% (5/80) of the dogs were positive and no amastigote forms of Leishmania sp. were detected

Surto de Trypanosoma vivax em rebanhos bovinos na Zona da Mata do estado de Pernambuco

Objetivou-se registrar a ocorrência e descrever os achados clínicos e hematológicos de surtos de tripanossomíase em bovinos em propriedades localizadas nos municípios de Timbaúba e Paudalho, Zona da Mata do estado de Pernambuco. Foram realizadas visitas às propriedades para coleta de dados sobre o histórico do rebanho além de informações sobre o manejo dos animais na propriedade, realização de exame clínico e coleta de material para hemograma, pesquisa de hematozoários e Reação em Cadeira da Polimerase. Clinicamente, os animais apresentavam mucosas hipocoradas, emaciação, havendo histórico de óbito em ambas as propriedades. Previamente ao manejo da ordenha era feita a aplicação de ocitocina, sendo ainda observada a presença de moscas hematófagas. Ao hemograma observou-se presença de anemia normocítica normocrômica e leucocitose por neutrofilia na maioria dos animais. Foi observada presença do protozoário Trypanosoma vivax no esfregaço sanguíneo e confirmados na PCR. Recomendou-se o tratamento com diaceturato de diminazene (10,5 mg/kg) em administração única. Conclui-se que o T. vivax, ocorre na região nordeste de maneira esporádica e que o manejo sanitário deficiente predispõe a ocorrência da enfermidade nos rebanhos

MOLECULAR DIAGNOSTIC OF HAEMONCHUS CONTORTUS RESISTANCE TO THE BENZIMIDAZOLE GROUP IN SHEEP AND GOATS IN THE STATE OF PERNAMBUCO, BRAZIL

Ovinos e caprinos sofrem grande prejuízo clínico provocados pela alta prevalência de parasitos gastrintestinais, principalmente pelo nematoda Haemonchus contortus. Este parasito causa alta morbidade e mortalidade, entretanto, o uso indiscriminado de fármacos para seu controle tem provocado a seleção de populações resistentes. O diagnóstico molecular da resistência ao grupo dos benzimidazóis (BZs) é muito importante para indicar estratégias substitutivas de manejo e controle. O objetivodeste estudo foi determinar pela primeira vez, a presença da mutação na posição F200Y do isotipo 1 do gene da beta-tubulina, em sete populações de H. contortus de ovinos e caprinos no estado de Pernambuco, Brasil. Amostras de DNA foram extraídas de 20 machos adultos, obtidos de animais naturalmente parasitados, em propriedades de Recife, Sairé, Camocim de São Félix, Gameleira, Moreno, Bonito e Serra Talhada. Os iniciadores forward: 5’ AAT GCT ACC CTT TCC GTC CAT C 3’ e reverse: 5’ CAA AAC CGGCA TGA AGA AG 3’ foram utilizados para a pesquisa da principal mutação no gene da beta-tubulina, para determinar a resistência ao grupo dos BZs. Os iniciadores NC1/ITS-2, forward: 5’ ACG TCT GGT TCA GGG TTG TT 3’ e reverse: 5’ TTA GTT TCT TTT CCT CCG CT 3’ foram usados para a confirmação de H. contortus. Um questionário foi utilizado para obtenção de informações sobre práticas de manejo, incluindo a frequência de uso dos BZs. As sequencias NC1/ITS-2 confirmaram a presença de H. contortus em todas as populações. A mutação F200Y responsável pela resistência (TTC/TAC) de H. contortus ao BZ, foi encontrada na amostra proveniente de Sairé, sendo que a proporção do códon TTC variou entre 55.6 a 85.7%. Relativo ao questionário, todos os produtores revelaram ausência de quarentena para os animais recém-adquiridos; alta frequência de aplicação de anti-helmínticos (60 em 60 dias); tratamento de todo o rebanho; estimativa visual do peso dos animais para cálculo da dosagem do medicamento; e alta rotação de antihelmínticos. Foi relatado ainda, a carência de assistência técnica especializada, sem exame rotineiro de fezes nos animais. Muito embora, todos estes fatores possam ser fundamentais para aumentar a pressão de seleção parasitária, não foi possível determinar qual deles poderia representar um ou mais fatores de risco, devido ao grande número de variáveis e o baixo número de respondentes. Esta é sem dúvida uma grande dificuldade para correlacionar os dados fenotípicos de eficácia (ex. TRCOF), com os marcadores genotípicos (ex. PCR) de resistência em helmintos. Foram incluídos os fatores de risco relatados por criadores de Pernambuco e sua influência nos processos de seleção anti-helmíntica, assim como estratégias para mitigar esta situação. Os dados apresentados são o primeiro registro molecular da mutação F200Y que confere resistência ao grupo dos BZs em pequenos ruminantes no estado de Pernambuco, Brasil. Sheep and goats suffer heavy losses due to the high prevalence of gastrointestinal nematodes, mainly from the nematode Haemonchus contortus. The parasite causes high morbidity and mortality, even though, the indiscriminate use of chemicals to control H. contortus has favored the selection of multidrug resistance parasites. Molecular diagnosis of resistance to the benzimidazole (BZs) group is important to indicate substitute strategies of control. The aim of this study was to determine the presence of the mutation at position F200Y of the beta-tubulin gene in seven populations of H. contortus from sheep and goats’ farms from the state of Pernambuco, Brazil. Twenty adult H. contortus male worms were recovered for DNAextraction from naturally infected animals, from farms from Recife, Sairé, Camocim deSão Félix, Gameleira, Moreno, Bonito, and Serra Talhada. The primers forward: 5` AAT GCT TCC ACC CTT GTC CAT C 3’, and reverse: 5’ CAA CAA CGG GCA TGA AGA AG 3’ were used to search for the main codon (F200Y) of the beta-tubulin gene to determine BZ resistance. The NC1/ITS-2 forward: 5’ ACG TCT GGT TCA GGG GTT TT 3’ and reverse: 5’ TTA TCT GTT TTT CCT GCC CT 3’ primers were used for confirming H. contortus species. A questionnaire was applied to obtain information on management practices, including the frequency of BZs use. The sequences from the NC1/ITS-2 confirmed the presence of H. contortus from all samples. The F200Y mutation responsible for BZ resistance (TTC/TAC) in H. contortus was found only in the samples from Sairé, as the TTC codon varied from 55.6 to 85.7%. In relation to the questionnaire, producers revealed the absence of quarantine for newly arrived animals; high drug treatment frequency (60-days interval); treatment of the whole flock; the visual estimation of the weight of the animals for dose determination; and high drug rotation. It was also mentioned the lack of veterinary assistance with no use of fecal exams. Even though, all these factors may be essential to increase parasite selection pressure, it was not possible to determine which of those showed a higher risk due to the high number of variables and the small number of participants. This is without any doubt one of the great difficulties to correlate phenotypic drug efficacy data (ex. FECRT) and genotypic-related (ex. PCR) resistance markers in helminths. We have included some risk factors reported by the farmers from Pernambuco and their influences in the process of drug selection, as well as a few strategies to mitigate this situation. The present report constitutes the first record of a molecular diagnosis of the mutation F200Y that confers resistance to the BZ group in ruminants in the state of Pernambuco, Brazil

Trypanosoma (Dutonella) vivax (Ziemann, 1905) em bovinos das diferentes mesorregiões do Estado de Pernambuco, Brasil

Trypanosoma vivax determina prejuízos à produção de ruminantes, relacionados com a morbidade, queda na produção, problemas reprodutivos além de mortalidade. O presente trabalho teve como objetivo realizar o diagnóstico de Trypanosoma (Dutonella) vivax em bovinos das diferentes Mesorregiões do Estado de Pernambuco, Brasil, através das técnicas de Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI) e da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Iniciamente foi realizada sorologia de 2.053 amostras de soro sanguíneo de bovinos provenientes de rebanhos de municípios do estado de Pernambuco. A partir destes resultados foram selecionados os municípios com maiores frequências de anticorpos em cada mesorregião do Estado de Pernambuco e foram coletadas um total de 127 amostras de sangue bovino para análise molecular através da PCR. À sorologia, 13,93% (286/2.053) dos animais foram reagentes para anticorpos IgG anti-Trypanosoma vivax. Já na PCR foi obtida uma positividade de 44,88% (57/127). Esses resultados sugerem que o estado de Pernambuco é área endêmica para Trypanosoma vivax, apresentando-se como área de instabilidade enzoótica e que a PCR mostrou-se eficiente no diagnóstico da infecção por Trypanosoma vivax em sangue de bovinos, sendo uma ferramenta indispensável para estudos epidemiológicos.Trypanosoma vivax determines losses in production of ruminants related to morbidity, decline in production, reproductive problems and also mortality. The objective of this study was to determine the diagnosis of Trypanosoma (Dutonella) vivax in cattle of different regions of Pernambuco State, Brazil, through the techniques of Indirect Immunofluorescence Assay (IFA) and Polymerase Chain Reaction (PCR). Firstly, it was performed a serology of 2,053 serum samples from bovine herds from different counties in the state of Pernambuco. From these results the counties with the highest frequency by IFA test were selected and a total of 127 bovine blood samples were collected for molecular analysis by PCR. The results of IFAT showed 13.93% (286/2,053) of positive animals for IgG antibodies against Trypanosoma vivax. The amplification by PCR revealed positivity of 44.88% (57/127). These results suggest that Pernambuco state is an area endemic for Trypanosoma vivax being considered an enzootic instability area. On the other hand, PCR was effective in the diagnosis of Trypanosoma vivax in cattle blood, being an indispensable tool for studies epidemiological

Prevalência e fatores de risco associados à infecção por Leishmania spp., Babesia caballi (Nuttall & Strickland, 1910), Theileria equi (Mehlhorn & Schein, 1998), Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1909), Neospora spp. em equídeos submetidos a diferentes regimes de criação

A equideocultura do Brasil ocupa posição de destaque mundial, com cerca de oito milhões de cabeças. Doenças causadas por protozoários como Babesia caballi, Theileria equi e Neospora spp. além de parasitos que causam protozooses zoonóticas a exemplo de Leishmania spp. e Toxoplasma gondii representam um dos principais entraves no desenvolvimento do setor. Diante disso, esse estudo tem como objetivo determinar as prevalências e fatores de risco associados às infecções por Leishmania spp., Babesia caballi (Nuttall & Strickland, 1910), Theileria equi (Mehlhorn & Schein, 1998), Toxoplasma gondii (Nicolle & Manceaux, 1909) e Neospora spp. em equídeos submetidos a diferentes regimes de criação. Para realização dos exames, foram analisadas 400 amostras de sangue total e soro de equídeos clinicamente saudáveis, incluindo equinos (387/400), muares (9/400) e asininos (4/400) provenientes de 41 propriedades rurais do estado de Pernambuco. Com a finalidade da detecção de Leishmania spp., foram realizados os exames parasitológicos diretos e Reação em cadeia da Polimerase (PCR). No intuito de averiguar a presença de infecção por Babesia caballi e Theileria equi foram utilizados os exames parasitológico direto e Ensaio de Imunoadsorção Enzimática (ELISA), para detecção de imunoglobulinas anti-Babesia caballi e anti-Theileria equi. Para determinação das soroprevalências da toxoplasmose e neosporose foram utilizados os testes de aglutinação modificado (MAT) para identificação de anticorpos IgG anti-T. gondii e IgG anti-Neospora spp. Todas as amostras resultaram negativas para Leishmania spp. nos testes, o que sugere que os equídeos não participam da cadeia epidemiológica das leishmanioses nas áreas estudadas. Quanto à presença de B. caballi e T. equi, os testes sorológicos revelaram uma prevalência de anticorpos anti-Babesia caballi e anti-Theileria equi de 4.3% (17/400; I.C. 2,6 – 6.9%) e 10,8% (43/400; I.C. 8.0 – 14.3), respectivamente e foi detectada co-infecção em 1% (4/400) dos animais. Tais dados permitem caracterizar como áreas de instabilidade enzoótica os locais pesquisados. Anticorpos IgG anti-T. gondii foram detectados em 12,5% (50/400) dos animais analisados. Quando avaliados os fatores de risco para infecção por T. gondii, apenas o fator mesorregião (p=0,029) apresentou associação com a infecção, particularmente Zona da Mata (OR=3). Os resultados revelam a presença do parasito na área estudada, o que pode representar um elo na cadeia de transmissão da toxoplasmose. A soropositividade para Neospora spp. total foi de 5,7% (23/400) e as variáveis idade, tipo de criação e região apresentaram significância estatística. Em relação à idade, observou-se que animais acima de 11 anos apresentaram 11,8 vezes de chances a mais de serem sororreagentes quando comparados com os animais jovens (<2,5) e a prevalência encontrada demonstra que o parasito está disperso nas áreas estudadas e que as variáveis idade, tipo de criação e região são fatores de riscos mais importantes para ocorrência da infecção em equídeos, devendo ser considerados na prevenção da doença. Considerando os resultados encontrados no presente estudo, o diagnóstico das diversas doenças presentes no estado de Pernambuco, quando realizado de forma precoce, possibilita a aplicação de medidas preventivas e de controle, contribuindo significativamente com a sanidade animal e saúde pública.The equid industry in Brazil occupies a prominent position worldwide, with about eight million equids. Diseases caused by protozoa such as Babesia caballi, Theileria equi and Neospora spp. as well as parasites that cause zoonotic protozooses such as Leishmania spp. and Toxoplasma gondii represent one of the main obstacles in the development of the sector. Therefore, this study aims to detect infection by Leishmania spp., Babesia caballi, Theileria equi, Toxoplasma gondii and Neospora spp. and their respective risk factors in equidae created with different management forms. To perform the tests, 400 samples of whole blood and serum from clinically healthy equines, including horses, mules and donkeys from 41 rural properties in the state of Pernambuco were analyzed. In order to detect Leishmania spp., direct parasitological and Polymerase Chain Reaction (PCR) tests were performed. Concerning the presence of infection by Babesia caballi and Theileria equi, direct parasitological tests and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used for anti-Babesia caballi and anti-Theileria equi immunoglobulins detection. For the determination of seroprevalences of toxoplasmosis and neosporosis, modified agglutination (MAT) tests were used to identify anti-T. gondii IgG antibodies and anti-Neospora spp. All samples were negative for Leishmania spp. in the tests, suggesting that equidae do not participate in the epidemiological chain of leishmaniasis in the studied areas. The prevalence of anti-Babesia caballi and anti-Theileria equi antibodies of 4.3% (17/400; CI: 2.6-6.9) and the presence of B. caballi and T. equi in the serological tests revealed a prevalence of 10.8% (43/400; CI: 8.0 - 14.3), respectively, and co-infection was detected in 1% (4/400) of the animals. These data allow the characterization of areas of enzootic instability in the sites surveyed. Anti-T. gondii IgG antibodies were detected in 12.5% (50/400) of the animals analyzed. When evaluating the risk factors for T. gondii infection, only the mesoregion factor (p = 0.029) was associated with infection, particularly Zona da Mata (OR = 3). The results reveal the presence of the parasite in the studied area, which may represent a link in the transmission chain of toxoplasmosis. Seropositivity for Neospora spp. was 5.7% (23/400) and the variables age, breeding type and region presented statistical significance. In relation to age, it was observed that animals older than 11 years presented 11.8 times more chances of being serum-reactive wjhen compared with young animals (<2,5) and the prevalence found shows that the parasite is dispersed in the areas studied and that the variables age, breeding type and region are the most important risk factors for the occurrence of infection in equidae, and should be considered in the prevention of the disease. Considering the results found in the present study, the diagnosis of the various diseases present in the State of Pernambuco, when performed at an early stage, allows the application of preventive and control measures, contributing significantly to animal health and public health

FREQÜÊNCIA DE AGLUTININAS ANTI-Brucella abortus EM CAPRINOS E OVINOS DO SERTÃO DO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL FREQUENCY OF ANTI-Brucella abortus AGGLUTININS IN GOATS AND sheep OF THE “SERTÃO” (BACKLANDS) OF THE STATE OF PERNAMBUCO, BRAZIL

Objetivou-se investigar a freqüência de aglutininas anti-Brucella abortus em caprinos e ovinos do Sertão do Estado de Pernambuco, Brasil. Foram processadas 700 amostras de soros sangüíneos, das quais 340 eram da espécie caprina (115 machos e 225 fêmeas) e 360 (136 machos e 224 fêmeas) ovina. Empregou-se a técnica do antígeno acidificado tamponado (AAT) corado com rosa bengala (RB). Das 340 amostras de caprinos avaliadas, duas (0,6%) foram reagentes ao AAT. Não se observaram associações significativas para as variáveis faixa etária (p= 0,430), raça (p= 0,936) e sexo (p= 0,562). Das 360 amostras de ovinos, nove (2,5%) foram reagentes. Também não houve associação significativa entre as variáveis analisadas e a soropositividade para brucelose: faixa etária (p= 0,522); raça (p= 0,576) e sexo (p= 0,461). Verificou-se associação significativa (p= 0,042) entre as espécies estudadas e soropositividade para brucelose nos animais investigados. A soropositividade para Brucella abortus em caprinos e ovinos foi descrita pela primeira vez no Sertão de Pernambuco, fato que pode dificultar o sucesso do Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose, tendo em vista que nessa região é comum a criação consorciada de pequenos ruminantes com bovinos, além de representar riscos à Saúde Pública.&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;PALAVRAS-CHAVES: Brucelose, ovinos, caprinos, pequenos ruminantes, sorodiagnóstico. The objective was to investigate the frequency of anti-Brucella abortus agglutinins in goats and sheep of the backlands of the State of Pernambuco, Brazil. 700 samples of sanguine serums were processed, of which 340 were of the goat (115 males and 225 females) and 360 (136 males and 224 females) sheep. The technique of the Tamponed Acidified Antigen (AAT) dyed with Bengalese Rose (BR) was used. Of the 340 samples of goat evaluated two (0.6%) were reactive to AAT. Significant associations were not observed for the variable age group (p = 0.430); race (p = 0.936) and sex (p = 0.562). Of the 360 sheep samples, nine (2.5%) were reactive. There also was no significant association between the analyzed variables and the seropositiveness for brucellosis: age group (p = 0.522); race (p = 0.576) and sex (p = 0.461). Significant association was observed (p = 0.042) among the studied species and seropositiveness for brucellosis in the investigated animals. The seropositiveness for Brucella abortus in goats and sheep was traced for the first time in the “Sertão” (dry interior region, backlands) of Pernambuco, fact that can hinder the success of the National Program of Control and Erradication of Brucellosis, due to the fact that it is common to raise small ruminants with bovines in this area, besides representing risks to Public Health. &lt;br /&gt; &lt;br /&gt;KEY WORDS: Brucellosis, ovines, caprines, small ruminants, serodiagnosis

Frequency of Toxoplasma gondii antibodies in bovines in the state of Pernambuco, Brazil

Toxoplasmosis is a parasitic disease caused by Toxoplasma gondii that affects homeothermic animals, including humans. Felines are considered the definitive host of this parasite, while other animals act as intermediate hosts. The purpose of this study was to assess the frequency of anti-T. gondii IgG antibodies in bovines in the state of Pernambuco, Brazil. Serum samples (n = 427) from animals in 13 municipalities of the coastal forest/plantation region of the state were analyzed using the immunofluorescent antibody test (IFAT). The overall results revealed a prevalence rate of 16.63% (27/427). High percentages of positivity were found among animals aged 25 to 36 months (28.57%; 30/42) and in males (22.22%; 2/9). The present findings suggest that bovine toxoplasmosis is endemic in the area under study

Development and assessment of a latex agglutination test based on recombinant MSP5 to detect antibodies against Anaplasma marginale in cattle

The recombinant protein MSP5 has been established as an important antigen for serological diagnosis of Anaplasma marginale by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, due to the high cost of specialized equipment, this technique is not accessible to all laboratories, especially in developing countries in areas where the disease is endemic. The present study describes the standardization of a latex agglutination test (LAT) to detect antibodies against A. marginale based on recombinant MSP5. Compared with indirect enzyme-linked immunosorbent assay (iELISA), the relative sensitivity and specificity of the LAT were 95.21% and 91.86% respectively, with an almost perfect agreement between tests (kappa index = 0.863). These results can be considered important for the serological diagnosis of A. marginale, as they indicate that the test represents a rapid and low cost alternative to ELISA

Molecular evidence of early vertical transmission of Leishmania ( Leishmania ) infantum in a dog

ABSTRACT: Visceral leishmaniasis (VL) is caused by the protozoon Leishmania infantum . Transmission of this parasite to hosts occurs mainly through the bite of infected sand flies. However, alternative infection routes have been hypothesized, especially in areas where the biological vector is absent. The exact time of infection and whether in utero transmission occurs have still not been fully elucidated. This report demonstrates molecular evidence of vertical transmission of L. infantum from a pregnant dog to the embryo. Samples (e.g. vulva, vagina, cervix, uterine body, uterine horn and ovaries) from a female naturally infected by L. infantum and from her embryo were molecularly analyzed by means of qPCR and cPCR followed by DNA sequencing. The gestational age was estimated to be 23±1 day. Through qPCR, the presence of L. infantum DNA was detected in all the samples analyzed (n=7), including the embryo, conversely through cPCR, only four samples (vagina, cervix, uterine body and embryo) were positive. This study demonstrated that transmission of L. infantum from a pregnant dog to the embryo might occur in the early days of pregnancy. In conclusion, this is the first report showing L. infantum infecting a canine embryo