Influencia de la necrosis tumoral en neuroblastoma sobre la migración de células NK.

El neuroblastoma es el tumor sólido extracraneal más común en niños, suponiendo el 8% de los casos de cáncer infantil. Mientras los casos de neuroblastoma de bajo riesgo tienen una tasa de supervivencia superior al 90%, el neuroblastoma de alto riesgo, con una alta probabilidad de no responder a los tratamientos convencionales, tiene una tasa de supervivencia a 5 años del 50%. Por lo tanto, es muy necesario el desarrollo de terapias específicas contra el neuroblastoma de alto riesgo. La terapia adoptiva con células NK es una de las líneas de investigación contra el cáncer infantil, ya que por lo general se tratan de tumores poco inmunogénicos, con una baja tasa de mutaciones, y contra los que las células NK se presentan como una herramienta terapéutica potente y segura. El neuroblastoma, como tumor sólido, presenta unas características en su microentorno tumoral que modulan la actividad de las células inmunes, como la presencia de necrosis tumoral y la oposición a la infiltración debido a la estructura del tumor, que pueden alterar los resultados de la terapia adoptiva con células NK. Además, mientras la inmunoterapia con anticuerpos monoclonales contra la vía de inmunosupresión PD1/PD-L1 ha sido ampliamente estudiada en linfocitos T, mostrando una gran relevancia, no ha sido tan estudiada en las células NK. Debido a esto, en este trabajo se ha estudiado la actividad citotóxica de las células NK expandidas in vitro con dos protocolos frente a cultivos tanto en 2D como en 3D de líneas celulares de neuroblastoma. Los cultivos en 3D presentan ciertas características del microentorno tumoral, mostrando mayor grado de semejanza con la complejidad de un tumor sólido. También se ha estudiado la expresión de PD1 en las células NK. La comparación de los protocolos de expansión mostró diferencias entre los niveles de citotoxicidad de las células NK observados con ambos procedimientos. Los cultivos en 3D mostraron mayor resistencia a la citotoxicidad de las células NK que los cultivos en 2D. Respecto al estudio de la expresión de PD1 en las células NK, se ha observado el aumento de la expresión en la membrana tras la incubación de las células NK con células tumorales, observándose niveles análogos a los presentes en pacientes con cáncer. Además, se observó una recuperación parcial de la actividad citotóxica de las células NK al añadir el anticuerpo anti-PD1. Estos resultados indican la relevancia de la vía PD1/PD-L1 en las células NK y su influencia por lo tanto en los tratamientos con inmunoterapia con células NK. <br /

Aplicación de nanomateriales al estudio y modulación de la respuesta inflamatoria en patologías inflamatorias y cáncer

La inflamación es un mecanismo clave en la regulación del sistema inmune, que permite la destrucción de agentes patógenos o la eliminación de células tumorales en condiciones fisiológicas. Sin embargo, cuando la respuesta inflamatoria no se regula de forma adecuada es la principal causa de enfermedades tipo inflamatorio y/o autoinmune de difícil tratamiento. Algunos miembros de la familia de las proteasas de serina, granzimas (gzms), como la gzmA o la gzmK, que ejercen funciones proinflamatorias regulando la producción de citocinas como IL-1β, IL-6 o TNF-α, modulan el balance entre inmunidad protectora o patológica. Recientemente en nuestro grupo de investigación se caracterizó que la gzmA juega un papel fundamental in vivo en algunos procesos inflamatorios como la sepsis bacteriana, la artritis o el cáncer colorrectal. Conjuntamente, se han detectado niveles elevados de la gzmA, gzmB y/o gzmK solubles en fluidos de pacientes con diversas patologías inflamatorias/autoinmunes. Sin embargo, se desconoce la relevancia fisiopatológica de estas gzms extracelulares y, aún más importante, si son funcionalmente activas en dichos fluidos y por lo tanto capaces de contribuir a la progresión de la enfermedad, pudiendo tratarse así tanto de posibles biomarcadores de pronóstico como de dianas terapéuticas. Durante los últimos años, la nanotecnología se ha convertido en una de las principales promesas en el campo del desarrollo de nuevos fármacos más selectivos y con menos efectos secundarios, ya que multitud de nanomateriales han mostrado ser soportes óptimos para la conjugación o vehiculización de moléculas a utilizar en aplicaciones biomédicas. En particular, las nanopartículas de oro (AuNPs) presentan ventajas adicionales con respecto a otros tipos de nanomateriales, exhibiendo excelentes propiedades físicas, químicas y biológicas, intrínsecas a su tamaño nanométrico, además de ser fácilmente sintetizadas y funcionalizadas con un amplio abanico de ligandos. Sin embargo, y aunque el oro se define como un metal seguro y estable, se ha demostrado que las propiedades fisicoquímicas de las AuNPs influyen directamente sobre su toxicidad. Por ello, la nanotoxicología, un área multidisciplinar recientemente emergida, plantea la realización, junto con los estudios más convencionales de citotoxicidad, como la generación de ROS, de un análisis más amplio y detallado de cada uno de los diferentes tipos de NPs, entre los que se incluyen los estudios de inmunogenicidad, ya que se ha demostrado que las NPs son capaces de interaccionar con los sistemas biológicos pudiendo llegar a causar multitud de efectos adversos.En este contexto, se planteó que la detección de la gzmA extracelular podría utilizarse como marcador de diagnóstico en sepsis, mientras que su inhibición selectiva haciendo uso de nanomateriales podría servir como posible diana terapéutica para reducir la inflamación asociada a ciertas patologías como el cáncer colorrectal, evitando los posibles efectos adversos generados por los tratamientos convencionales. Asimismo, el estudio más exhaustivo de la influencia de estos nanomateriales sobre la respuesta inmune podría ser clave para confirmar su seguridad e impulsar su uso responsable y sostenible.Mediante la realización de este trabajo, por un lado, se ha conseguido el desarrollo de un biosensor específico de la gzmA, tanto de origen murino como humano, basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia, con una alta sensibilidad así como estabilidad. Mediante el uso de este biosensor, además se ha apoyado la implicación de la gzmA extracelular en la patogénesis de la sepsis y se ha correlacionado la actividad enzimática de dicha proteasa, con el estado de los pacientes con septicemia. Por otro lado, se ha comprobado como las nanocápsulas de quitosano, ampliamente empleadas para la encapsulación de siARN en terapia génica, son internalizadas en el interior de linfocitos T y células NK en un intervalo de tiempo relativamente corto y sin mostrar toxicidad sobre las mismas, representando así un posible sistema de vehiculización adecuado para el silenciamiento de la gzmA. Junto con los estudios de internalización, se han realizado estudios de biodistribución de estos sistemas, ya sea a escala nano o micro, demostrando que las nanocápsulas y microcápsulas de quitosano permiten actuar de forma localizada aumentando el tiempo de retención en la zona del intestino, gracias a las propiedades mucoadhesivas, además de ser completamente eliminadas del organismo sin llegar a producirse su integración en la vía sistémica, lo cual disminuye el riesgo de toxicidad. Por último, también se ha analizado el posible efecto inmunomodulador de las AuNPs, con un tamaño de 14 nm recubiertas con PEG-N3 y PEG-COOH con el 100% de la superficie saturada, y se ha evidenciado que son capaces de modular la producción de citocinas inflamatorias in vitro en macrófagos con fenotipo proinflamatorio o M1 y antiinflamatorio o M2 inducida por lipopolisacárido, así como inhibir la maduración de las células dendríticas analizada por la expresión de las moléculas de superficie CD40, CD80, CD86 y MHCII. Gracias a los ensayos in vivo, se ha manifestado que la presencia de las AuNPs en el microambiente tumoral del melanoma murino B16, provoca un incremento en la expresión de determinados mediadores pro- y antiinflamatorios, así como una alteración de las distintas poblaciones celulares que lo conforman, además de provocar una polarización de los macrófagos asociados a tumor hacia un fenotipo M2 y un aumento de la expresión del factor antitumoral TNF-α, mejorando así la sensibilidad del melanoma al tratamiento con anti-PD-1.<br /

Actividad antitumoral del alcaloide natural Berberina en células hematopoyéticas

La berberina es una alcaloide presente en diversas zonas de muchas plantas que se lleva usando mucho tiempo en la medicina tradicional china. Se ha demostrado su efecto beneficioso en muchos campos de la medicina, e incluso existen ensayos clínicos en los que se está probando su valía. Uno de los campos en los que la berberina ha demostrado tener potencial es en el del cáncer. Aunque no existen ensayos clínicos, la berberina posee actividad antitumoral frente a muchos tipos de tumores. El mecanismo por el cual la berberina elimina las células tumorales parece ser mayoritariamente la inducción de la apoptosis a través de la ruta mitocondrial. Aunque la berberina presenta actividad antitumoral frente a diversos tipos de tumores sólidos como hematológicos “in vitro”, existen muy pocos estudios sobre la eficacia y el mecanismo de acción de la berberina contra neoplasias hematológicas en comparación con carcinomas sólidos, y solo un estudio ha analizado el papel de la berberina en pacientes con leucemia mieloide aguda. En este trabajo fin de master se propuso arrojar más luz sobre las capacidades antitumorales de la berberina en tumores hematológicos, comprobando que ejerce una actividad citotóxica en las cuatro líneas analizadas. Se han obtenido datos, aunque no del todo concluyentes sobre la implicación de las proteínas de la familia Bcl2 en el mecanismo de muerte activado. Nos propusimos realizar ensayos en muestras de pacientes con neoplasias hematológicas, obteniendo datos satisfactorios tanto por su acción antitumoral como por la baja toxicidad secundaria que presenta en las células mononucleadas de la sangre periférica. Por último se estudió el potencial antitumoral “in vivo” frente al desarrollo tumoral de un linfoma T en ratones autotrasplantados, observándose que reduce el crecimiento, la invasividad y la angiogénesis

Revisiting molecular weight distribution of polystyrenes using adsorption highperformance thin-layer chromatography

A repeatable separation of polystyrenes according to MW, from 1920 to 520000 u.m.a, has been obtained under adsorption conditions using a method that comprises the use of Lichrospher HPTLC plates, and a controlled, isocratic elution with a 78:22 (v/v) mixture of cyclohexane (Cy)-tetrahydrofuran (THF). Likewise, UV-densitometric quantification of polystyrenes in mixtures can be achieved, by an intra-plate or an inter-plate procedure, using the corresponding polystyrene calibration curve. In the case or overlapped, unresolved peaks, an average curve of the corresponding polystyrenes can be used. Migration of polystyrenes strongly varies with slight variations in the relative proportion of Cy and THF in the mobile phase. This allows different ranges of MW to be separated as a function of mobile phase composition. Other factors influencing repeatability have been identified. Some reasons have been advanced to explain the current lack of activity in the research on polymer characterization by HPTLC. Old literature results concerning polystyrene separation have also been discussed in the light of modern HPTLC instrumentation. Developed method provides similar information on Molecular Weight Distribution (MWD) to that obtained using Gel Permeation Chromatography (GPC). Advantages and limitations of HPTLC for obtaining polymer MWD have also been discussed.Authors thank the Spanish Ministerio de Ciencia e Innovación (MICINN) and FEDER (UE) for financial support (Plan Nacional de I+D+I, project CTQ2008-00959)Peer reviewe

Estudio de la toxicidad ambiental e in vivo de los materiales grafénicos

Realizar el estudio tanto de la toxicidad ambiental in vivo como de la toxicidad in vitro de los materiales grafénicos GOQDs, obtenidos a partir de las nanofibras de grafeno del Instituto de Carboquímica de Aragón, con el objetivo de conocer su viabilidad en el campo biomédico. Los GOQDs son materiales nanométricos obtenidos a partir de grafenoque presentan unas propiedades ópticas y electrónicas únicas. Es por ello, que pueden ser utilizados en múltiples aplicaciones biomédicas como biosensores, marcadores químicos etc. <br /

Gliotoxina, un nuevo candidato contra Staphylococcus aureus resistente a meticilina que muestra un efecto sinérgico con fármacos antimicrobianos en el modelo de infección Caenorhabditis elegans

Comunicación oral presentada en el Congreso Virtual de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC), 4-6 junio de 2020.[Introducción/Objetivos]: las bacterias resistentes a múltiples fármacos como el Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) se encuentran entre las principales causas de infecciones adquiridas en el hospital o en la comunidad, y representan un desafío para el sistema de salud. Por lo tanto, es importante encontrar nuevos medicamentos que muestren actividad contra estas bacterias, tanto en monoterapia como en combinación con otros medicamentos antimicrobianos. La gliotoxina es una micotoxina producida por Aspergillus fumigatus y otros hongos del género Aspergillus. Alguna evidencia sugiere que la gliotoxina muestra actividad antimicrobiana, especialmente contra S. aureus. Este trabajo tiene como objetivo evaluar la eficacia antibiótica de la gliotoxina como monoterapia o en combinación con otros agentes terapéuticos contra MRSA in vitro e in vivo utilizando un modelo de infección por C. elegans.[Material y métodos]: La sensibilidad de MRSA ATCC700699 contra la gliotoxina se analizó mediante diferentes métodos: difusión en disco, curvas de mortalidad-tiempo y ensayos de microdilución. Los efectos sinérgicos de la gliotoxina con otros medicamentos antiestafilocócicos (vancomicina, ácido fusídico y linezolid) se probaron mediante un ensayo de tablero de ajedrez. Los gusanos sincronizados de C. elegans L4 se infectaron con MRSA. El cultivo se complementó por separado con gliotoxina, vancomicina o su combinación a diferentes concentraciones. La tasa de supervivencia de C. elegans se evaluó manualmente cada 12 h durante 4 días.[Resultados]: El análisis de sensibilidad de MRSA contra la gliotoxina mostró que la gliotoxina tiene una potente actividad antimicrobiana (MIC = 2 µg / ml). Además, se observó actividad sinérgica, cuando la gliotoxina se combinó con vancomicina y ácido fusídico, usando ensayos de tablero de ajedrez y curvas de muerte. Este efecto sinérgico fue confirmado por el software CalcuSyn (IC = 0.15 para 1 µg / ml de gliotoxina combinada con 2 µg / ml de vancomicina). El estudio in vivo de la infección por S. aureus en un modelo de C. elegans mostró que el tratamiento combinado de vancomicina con gliotoxina aumentó un 70% en la tasa de supervivencia de los gusanos infectados con MRSA.[Conclusiones]: nuestros resultados sugieren que la gliotoxina es efectiva contra las cepas de MRSA, lo que indica su posible uso como un nuevo fármaco contra las infecciones por MRSA.Peer reviewe

PD-1 is expressed in cytotoxic granules of NK cells and rapidly mobilized to the cell membrane following recognition of tumor cells

5 figures.-- Supplementary information available.The contribution of the T cell-related inhibitory checkpoint PD-1 to the regulation of NK cell activity is still not clear with contradictory results concerning its expression and role in the modulation of NK cell cytotoxicity. We provide novel key findings on the mechanism involved in the regulation of PD-1 expression on NK cell membrane and its functional consequences for the elimination of cancer cells. In contrast to freshly isolated NK cells from cancer patients, those from healthy donors did not express PD-1 on the cell membrane. However, when healthy NK cells were incubated with tumor target cells, membrane PD-1 expression increased, concurrent with the CD107a surface mobilization. This finding suggested that PD-1 was translocated to the cell membrane during NK cell degranulation after contact with target cells. Indeed, cytosolic PD-1 was expressed in freshly-isolated-NK cells and partly co-localized with CD107a and GzmB, confirming that membrane PD-1 corresponded to a pool of preformed PD-1. Moreover, NK cells that had mobilized PD-1 to the cell membrane presented a significantly reduced antitumor activity on PD-L1-expressing-tumor cells in vitro and in vivo, which was partly reversed by using anti-PD-1 blocking antibodies. Our results indicate that NK cells from healthy individuals express cytotoxic granule-associated PD-1, which is rapidly mobilized to the cell membrane after interaction with tumor target cells. This novel finding helps to understand how PD-1 expression is regulated on NK cell membrane and the functional consequences of this expression during the elimination of tumor cells, which will help to design more efficient NK cell-based cancer immunotherapies.Work in the JP laboratory is funded by FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional), Gobierno de Aragón (Group B29_20R), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCUN), Agencia Estatal de Investigación (SAF2017-83120-C2-1-R; PID2020-113963RBI00), Fundación Inocente Inocente, ASPANOA, and Carrera de la Mujer de Monzón. Postdoctoral Juan de la Cierva Contract (MA and LS) and Predoctoral Grant from AECC (CP). JP is supported by ARAID Foundation; Fundación Agencia Aragonesa para la investigación y el Desarrollo; Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer.Peer reviewe

Análisis de la actividad antimicrobiana de la Gliotoxina en diferentes microorganismos de interés clínico

Trabajo presentado en el XXIV Congreso Nacional de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC), celebrado de manera virtual del 5-11 junio de 2021.[Introducción/Objetivos]: la gliotoxina es una micotoxina producida por Aspergillus fumigatus y otros hongos del género Aspergillus. Es un metabolito secundario perteneciente a la familia de las epipolitiodioxopiperazinas, caracterizada por la presencia de un puente disulfuro interno en un anillo de piperazina, que parece ser necesario para la mayoría de las propiedades biológicas de este compuesto. Se ha demostrado que la gliotoxina es un factor de virulencia durante la aspergilosis invasiva y presenta una toxicidad notable contra las células de mamíferos. Sin embargo, las evidencias científicas sobre su potencial actividad antimicrobiana son escasas. Por lo tanto, este trabajo tiene como objetivo evaluar su eficacia antibiótica contra microorganismos de interés clínico como Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa; y antifúngico contra Candida albicans y Candida glabrata. [Material y métodos]: la sensibilidad a la gliotoxina de diferentes cepas (incluidas las farmacorresistentes) de los microorganismos indicados se analizó por diferentes métodos: métodos de difusión en disco (antibiogramas/antifungigramas), estudio de curvas de tiempo-mortalidad, métodos de microdilución y ensayo MTT. Para los aislados de Candida, los resultados fueron confirmados mediante el análisis de la muerte celular por citometría de flujo. [Resultados]: Los resultados sugieren una potente actividad antimicrobiana de gliotoxina contra Candida albicans y Staphylococcus aureus, incluso en las cepas resistentes a azoles y a meticilina, respectivamente. En el caso de Escherichia coli y Candida glabrata, la gliotoxina ejerce una acción antimicrobiana moderada. Sin embargo, Pseudomonas aeruginosa parece ser resistente a la gliotoxina. [Conclusiones]: Nuestros resultados indican que la gliotoxina es efectiva contra Candida albicans y Staphylococcus aureus por lo que podría usarse como una alternativa para el tratamiento de infecciones causadas por cepas resistentes a antibióticos/antifúngicos. Sin embargo, será necesario aclarar aún más los mecanismos por los cuales la gliotoxina ejerce este efecto y probar en modelos apropiados in vivo la viabilidad de su uso teniendo en cuenta los posibles efectos secundarios debido a su toxicidad. En este sentido, planeamos analizar su eficacia y seguridad en un modelo de infección cutánea causada por Staphylococcus aureus.Peer reviewe

All about (NK cell-mediated) death in two acts and an unexpected encore: initiation, execution and activation of adaptive immunity

3 figures.NK cells are key mediators of immune cell-mediated cytotoxicity toward infected and transformed cells, being one of the main executors of cell death in the immune system. NK cells recognize target cells through an array of inhibitory and activating receptors for endogenous or exogenous pathogen-derived ligands, which together with adhesion molecules form a structure known as immunological synapse that regulates NK cell effector functions. The main and best characterized mechanisms involved in NK cell-mediated cytotoxicity are the granule exocytosis pathway (perforin/granzymes) and the expression of death ligands. These pathways are recognized as activators of different cell death programmes on the target cells leading to their destruction. However, most studies analyzing these pathways have used pure recombinant or native proteins instead of intact NK cells and, thus, extrapolation of the results to NK cell-mediated cell death might be difficult. Specially, since the activation of granule exocytosis and/or death ligands during NK cell-mediated elimination of target cells might be influenced by the stimulus received from target cells and other microenvironment components, which might affect the cell death pathways activated on target cells. Here we will review and discuss the available experimental evidence on how NK cells kill target cells, with a special focus on the different cell death modalities that have been found to be activated during NK cell-mediated cytotoxicity; including apoptosis and more inflammatory pathways like necroptosis and pyroptosis. In light of this new evidence, we will develop the new concept of cell death induced by NK cells as a new regulatory mechanism linking innate immune response with the activation of tumour adaptive T cell responses, which might be the initiating stimulus that trigger the cancer-immunity cycle. The use of the different cell death pathways and the modulation of the tumour cell molecular machinery regulating them might affect not only tumour cell elimination by NK cells but, in addition, the generation of T cell responses against the tumour that would contribute to efficient tumour elimination and generate cancer immune memory preventing potential recurrences.This research was supported by CIBER -Consorcio Centro de Investigación Biomédica en Red- (CB 2021), Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Ciencia e Innovación and Unión Europea – NextGenerationEU, FEDER (Fondo Europeo de Desarrollo Regional, Gobierno de Aragón (Group B29_20R), Ministerio de Ciencia, Innovación e Universidades (MCNU), Agencia Estatal de Investigación (SAF2017-83120-C2-1-R; PID2020-113963RB-I00), ASPANOA, Donación Javier Saura Carceller, and Carrera de la Mujer de Monzón. JP was supported by Fundacion Aragon I+D (ARAID). MA was granted by a Juan de la Cierva contract of Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (IJC2019-039192-I). LS was granted by a Juan de la Cierva contract of Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (FJC2020-046181-I). IU-M and SH are supported by a PhD fellowship from Aragon Government, CP by a PhD fellowship from Fundación Científica de la Asociación Española Contra el Cáncer (FC AECC), MG-T by a PhD fellowship (FPI) from the Ministry of Science, Innovation and Universities. CO was granted by AEI -Agencia Estatal de Investigación- (PTA2020-018510-I / AEI / 10.13039/501100011033).Peer reviewe

How could antibiotics, probiotics, and corticoids modify microbiota and its influence in cancer immune checkpoint inhibitors: a review

Immunotherapy has become a new paradigm in oncology, improving outcomes for several types of cancer. However, there are some aspects about its management that remain uncertain. One of the key points that needs better understanding is the interaction between immunotherapy and gut microbiome and how modulation of the microbiome might modify the efficacy of immunotherapy. Consequently, the negative impact of systemic antibiotics and corticosteroids on the efficacy of immunotherapy needs to be clarified.Peer reviewe