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Characterization and potential roles of calretinin in rodent spermatozoa
Get PDFCalretinin has been detected in various excitable cells but the presence and putative roles of such a calcium-binding protein has never been characterized in sperm.Epididymal spermatozoa were collected from C57Bl6 (wild-type, WT) or calretinin knockout (CR−/−) mice and Wistar rats. A specific staining for calretinin was detected by immunofluorescence in the principal piece of the flagellum, both in WT mouse and rat spermatozoa. Western blots confirmed the expression of calretinin in rat and WT spermatozoa as well as its absence in CR−/− mice.No significant difference was observed in the spontaneous acrosome reaction between WT and CR−/− sperm. The addition of the calcium-ionophore A-23187, Thapsigargin or Progesterone to WT or CR−/− incubated spermatozoa induced increases in the acrosome reaction but the stimulatory effects were identical in both genotypes. Motility measurements assessed by computer-assisted sperm analysis indicated that, under basal non-stimulatory conditions, CR-/- sperm exhibited a lower curvilinear velocity and a smaller lateral head movement amplitude, although no difference was observed for the beat cross frequency. After incubation with 25 mM NH4Cl, the curvilinear velocity, the amplitude of the lateral head movement and the hyperactivation were increased, while the beat cross frequency was decreased, in both genotypes.Evaluation of the in vivo fertility potential indicated that the CR−/− litter sizes were clearly reduced compared to the WT litter sizes.Our study describes, for the first time, the expression of calretinin in sperm. These data extend the potential implication of calcium-binding proteins in the sperm calcium-signaling cascade and bring new insights into the understanding of sperm physiology
Caractérisation et rôles potentiels des "Calcium-Binding Proteins" dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes
No full textLa fécondation dépend de la capacité de deux cellules uniques à s’unir :l’ovocyte et le spermatozoïde. Alors que le stock d’ovocytes est établi dès la puberté, les spermatozoïdes sont produits de façon continue à partir d’une réserve de cellules germinales souches (spermatogonies). Immobile et inapte à la fécondation, le spermatozoïde testiculaire doit subir un processus de maturation qui débute dans l’épididyme et se poursuit dans les voies génitales femelles. Bien qu’une première forme de mobilité soit acquise au contact du fluide épididymaire, le spermatozoïde subit, tout au long de son parcours dans le tractus femelle, de nombreuses modifications structurelles et biochimiques appelées « capacitation » et qui s’avèrent indispensables à l’acquisition de son pouvoir fécondant. La production de spermatozoïdes fertiles est un processus hautement régulé, notamment via l’ion calcium ;second messager crucial de nombreux processus de signalisation intracellulaire. Les modifications de la concentration intracellulaire de calcium sont indispensables pour le développement du potentiel de fécondation du sperme via la modification du profil de mobilité vers l’hyperactivation ou encore la réalisation de la réaction acrosomiale. Différents mécanismes de régulation de la concentration intracellulaire calcique ont déjà été mis en évidence dans les spermatozoïdes :canaux calciques, réserves intracellulaires de calcium… Toutefois, peu d’informations relatent la présence et/ou l’implication de protéines liant le calcium (Calcium-Binding Proteins - CaBP) au sein de ce type cellulaire.Notre étude a pour but de caractériser la présence et l’implication potentielle de EF-Hand CaBP dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes murins. Nous nous sommes principalement focalisés sur l’étude de trois membres de cette famille protéique :la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine. Nos investigations ont été menées de manière comparative entre des spermatozoïdes de type Wild-type (WT) et des spermatozoïdes n’exprimant pas une ou plusieurs CaBP (calrétinine knock-out - CR-/-, calbindine D-28k - knock-out CB-/-, triple knock-out pour la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine - CR-/-CB-/-PV-/-). La première partie de notre projet décrit la localisation et l’expression de la calrétinine, la calbindine D-28k et la parvalbumine dans les spermatozoïdes de souris et de rats par immunofluorescence et Western blotting. Ces protéines ont été localisées au niveau de la pièce principale du flagelle et au niveau de la Redundant Nuclear Envelope dans le cas de la parvalbumine. Au cours de la seconde partie du projet, des études de mobilité ainsi que des quantifications du taux de réaction acrosomiale ont été menées en comparant les spermatozoïdes WT aux cellules CR-/- et CR-/-CB-/-PV-/-. Alors qu’aucune différence n’a été constatée entre les taux de réaction acrosomiale WT versus knock-out tant en condition basale qu’induite, l’absence d’une ou plusieurs protéines apparaît influencer certains paramètres de mobilité des spermatozoïdes. En effet, les spermatozoïdes CR-/- et CR-/-CB-/-PV-/- ont présenté une fréquence du battement de flagelle (BCF) plus élevée par rapport à la fréquence mesurée chez les spermatozoïdes WT, paramètre modifié notamment au cours de l’hyperactivation. Cette différence pourrait être liée à une modification du tamponnage calcique ou à une régulation différente du canal calcique CatSper, acteur majeur du développement de l’hyperactivation. Les résultats préliminaires des mesures électrophysiologiques suggèrent un rôle potentiel de la calrétinine dans la régulation de l’activité de ce canal. Par ailleurs, la comparaison entre le nombre de petits par portées WT par rapport aux portées CR-/- ou CR-/-CB-/-PV-/- a indiqué que l’absence d’expression d’une ou plusieurs EF-Hand CaBP réduisait le nombre de naissances par portée au sein des génotypes knock-out.En conclusion, l’ensemble de nos résultats expérimentaux ont démontré la présence de trois EF-Hand CaBP au niveau des spermatozoïdes murins et permis d’apporter de nouvelles informations quant à l’implication potentielle de celles-ci dans l’acquisition du pouvoir fécondant des spermatozoïdes.Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine)info:eu-repo/semantics/nonPublishe
Expression of Calbindin and Calretinin in murine spermatozoa
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Detection of EF-Hand Calcium-Binding Proteins in Epididymal Murine Sperm
No full textinfo:eu-repo/semantics/nonPublishe
New insights in acetaminophen toxicity: HMGB1 contributes by itself to amplify hepatocyte necrosis in vitro through the TLR4-TRIF-RIPK3 axis.
No full textExtracellular release of HMGB1 contributes to acetaminophen-induced liver injury. HMGB1 acts as a danger-associated molecular patterns during this toxic process but the mechanisms of action and targeted cells are incompletely defined. Here we studied, in vitro, the role of HMGB1 in amplifying the acetaminophen-induced hepatocyte necrosis process. Using cultured HepaRG cells, primary human hepatocytes and selective chemical inhibitors we evaluated acetaminophen-induced toxicity. We confirmed that addition of acetaminophen induced HepaRG cell death and HMGB1 release. We showed that inhibition of HMGB1 decreased acetaminophen-induced HepaRG cell death, suggesting a feedforward effect. We provide the first evidence that exposure of HepaRG cells to recombinant human HMGB1 (rhHMGB1) also resulted in cell death. Moreover, we found that both acetaminophen and rhHMGB1 induced programmed HepaRG cell necrosis through a RIPK3-dependent mechanism. By using TLR4 blocking antibody, we demonstrated the reduction of the HepaRG cell death induced by acetaminophen and rhHMGB1. Furthermore, inhibition of TRIF, known to induce a RIPK3-dependent cell death, reduced rhHMGB1-induced HepaRG cell death. Our data support that released HMGB1 from acetaminophen-stressed hepatocytes induced necrosis of neighboring hepatocytes by TLR4-TRIF-RIPK3- pathway. This in vitro study gives new insights in the role of HMGB1 in the amplification of acetaminophen-induced toxicity
