Avaliação dos efeitos antitumoral e anti-inflamatório do extrato bruto e das frações purificadas bioativas de Uncaria tomentosa (Wild) DC. em modelos experimentais de câncer de bexiga e de cistite hemorrágica

A bexiga é um órgão constantemente exposto a compostos tóxicos provenientes do metabolismo, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias quando não tratada adequadamente. A cistite hemorrágica é uma condição inflamatória generalizada da bexiga caracterizada por eventos inflamatórios intensos e normalmente associada ao uso de fármacos antineoplásicos como a ciclofosfamida. Para a prevenção da ocorrência da cistite hemorrágica o fármaco 2-mercaptoetanosulfonato de sódio (Mesna) tem sido utilizado, apesar deste composto não ser eficiente em lesões já estabelecidas. Em relação ao câncer de bexiga, este é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato genitourinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. O tratamento varia conforme a natureza invasiva do tumor, sendo que para a prevenção da recorrência deste câncer, quimioterapia ou imunoterapia adjuvante têm sido utilizadas. Contudo, a administração intravesical de BCG é o tratamento mais efetivo do câncer de bexiga superficial, porém apresenta inúmeros efeitos colaterais, onde aproximadamente um terço dos pacientes progridem para um estágio superior. Tanto a cistite hemorrágica quanto o câncer de bexiga permanecem como desafios terapêuticos, uma vez que a eficácia dos tratamentos muitas vezes, é insuficiente. Na busca de novos tratamentos, pesquisas tentam encontrar compostos a partir de plantas medicinais com baixa toxicidade. Neste contexto, a Uncaria tomentosa merece destaque, uma vez que cascas e raízes da espécie são amplamente empregadas na medicina popular para inúmeras enfermidades, como doenças do trato urinário e câncer. Considerando estes dados, o objetivo deste estudo foi investigar o efeito do extrato bruto hidroetanólico e das frações purificadas de alcalóides oxindólidos e de glicosídeos do ácido quinóvico da planta Uncaria tomentosa sobre a proliferação de células tumorais de bexiga e sobre um modelo de cistite hemorrágica em camundongos. Demonstramos no Capítulo 1 que a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico foi capaz de inibir o crescimento e a viabilidade celular das linhagens de câncer de bexiga humano T24 e RT4. Na linhagem T24, esta fração induziu significativamente a apoptose pela inibição da ciclooxigenase 2, sem causar parada no ciclo celular. Embora mais investigações sejam necessárias, hipotetizamos que esta inibição possa estar ocorrendo via inibição do fator de transcrição NF-κB. No Capítulo 2, demonstramos que esta mesma fração purificada foi capaz de promover uma redução significativa no edema e no peso das bexigas dos animais previamente tratados com este composto, demonstrando atividade equivalente à Mesna. Assim como para os experimentos in vitro, nos experimentos in vivo, supomos que a reversão dos danos induzidos pela ciclofosfamida, provavelmente esteja associada à capacidade desta fração em inibir a ativação do fator de transcrição NF-κB, o qual poderia estar agindo de modo a prevenir os efeitos colaterais provocados pela ciclofosfamida. A partir dos resultados obtidos, fica evidente que esta investigação demonstra promissoras propriedades antitumoral e anti-inflamatória para a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento destas patologias da bexiga.The bladder is an organ constantly exposed to toxic compounds from the metabolism, whose chronic exposure can lead to various diseases, if not appropriately treated. Hemorrhagic cystitis is an inflammatory condition of bladder characterized by intense inflammatory events associated with the use of anticancer drugs such as cyclophosphamide. To prevent the occurrence of hemorrhagic cystitis sodium 2- mercaptoethanesulfonate (Mesna) has been used, although this compound is not effective in established lesions. Regarding bladder cancer, this is characterized as the second most common malignancy of the genitourinary tract and the seventh more prevalent cancer among men in the world. The treatment depends on tumor invasiveness. To prevent recurrence of bladder cancer, adjuvant chemotherapy or immunotherapy has been used. However, the intravesical administration of BCG is the most effective treatment of superficial bladder cancer. Nevertheless, many side effects are common and approximately one third of cancer cases progress to higher stage. So, both hemorrhagic cystitis and bladder cancer remain like therapeutic challenges, since the effectiveness of treatment is often insufficient. In the search for new treatments, researches have been trying to find compounds from medicinal plants with low toxicity. In this context, Uncaria tomentosa is noteworthy, since barks and roots of this species are widely used in folk medicine for numerous diseases such as urinary tract disease and cancer. Considering these data, the objective of this study was to investigate the effect of crude extract hydroethanolic and purified fractions of Uncaria tomentosa on the proliferation of bladder cancer cells and on a model of hemorrhagic cystitis in mice. We demonstrated in the Chapter 1, that the quinovic acid glycoside purified fraction was able to inhibit the growth and viability of T24 and RT4 human bladder cancer cells. In T24 cells, this fraction significantly induced apoptosis by inhibition of cyclooxygenase 2, without causing cell cycle arrest. Although further investigations are necessary, we hypothesized that this effect may be occurring by inhibition of the transcription factor NF-κB. In the Chapter 2, we demonstrated that the same purified fraction was able to promote a significant reduction on edema and weight of mice bladders, showing activity equivalent to Mesna. In these experiments, we assume that the reversal effect of the damage induced by cyclophosphamide probably is related to the ability of this fraction to inhibit the activation of the transcription factor NF-κB, which could be acting to prevent the side effects caused by cyclophosphamide. Considering these results, it is evident that this research shows promising antitumor and anti-inflammatory properties for the quinovic acid glycosides purified fraction, which may in future, become a potential therapeutic agent in treatment of bladder diseases

Envolvimento da sinalização purinérgica em estratégias terapêuticas para o tratamento da cistite hemorrágica e do câncer de bexiga

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24.The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line

Envolvimento da sinalização purinérgica em estratégias terapêuticas para o tratamento da cistite hemorrágica e do câncer de bexiga

A bexiga urinária é exposta constantemente a substâncias potencialmente prejudiciais presentes na urina, cuja exposição crônica pode levar a diversas patologias. Dentre estas patologias está a cistite hemorrágica que é uma condição inflamatória grave da bexiga associada ao uso de fármacos quimioterápicos, como a ciclofosfamida. É descrito que a exposição em longo prazo à ciclofosfamida aumenta o risco de desenvolvimento do câncer de bexiga, o qual é caracterizado como sendo a segunda neoplasia mais comum do trato urinário e o sétimo câncer mais prevalente entre homens no mundo. Alterações na sinalização purinérgica têm sido evidenciadas em diferentes patologias associadas à bexiga urinária. De fato, o sistema purinérgico tem emergido como um potencial alvo a ser estudado. Portanto, nesta tese buscou-se avaliar o envolvimento da sinalização purinérgica em um modelo in vivo de cistite hemorrágica e em um modelo in vitro de câncer de bexiga. No intuito de identificar estratégias preventivas e tratamentos eficazes para reduzir a morbidade e a mortalidade associadas à cistite hemorrágica, a espécie Uncaria tomentosa foi investigada, devido a sua ampla utilização em casos de inflamação crônica e doenças do trato urinário. A partir dos estudos conduzidos in vivo, demonstramos que o tratamento sistêmico com a fração purificada de glicosídeos do ácido quinóvico de U. tomentosa foi capaz de prevenir os eventos nociceptivos e inflamatórios associados à cistite hemorrágica. A diminuição da expressão dos receptores P2X7, provavelmente pela inibição da migração dos neutrófilos ao local da inflamação foi observada, evidenciando propriedades anti-inflamatórias promissoras para esta fração podendo, no futuro, se tornar um agente terapêutico potencial no tratamento desta patologia. Para o câncer de bexiga músculo invasivo, a cistectomia radical é considerada o tratamento padrão, porém está associada à morbidade significativa. Na tentativa de proporcionar uma melhor qualidade de vida aos pacientes, o interesse por abordagens terapêuticas que visam à preservação da bexiga urinária tem aumentado. Neste sentido, a radioterapia tem recebido destaque por ser uma modalidade de tratamento já utilizada. Desta forma, investigamos os efeitos da radioterapia sobre a sinalização purinérgica em linhagem celular de câncer de bexiga humano T24. Dentre os receptores expressos pelas células T24, o receptor P2X6 apresentou aumento expressivo após a radioterapia. A partir da análise de pacientes com câncer de bexiga (Kaplan-Meier), evidenciamos a relação existente entre a alta expressão deste receptor e o aumento da taxa de sobrevivência. Na sequência, o provável envolvimento da família das ectonucleotidases nos efeitos da radioterapia na linhagem celular T24 também foi avaliado. Observamos que a sinalização purinérgica, principalmente via hidrólise do ATP à adenosina pela ação combinada de ectoenzimas demonstrou papel importante no tratamento radioterápico in vitro. A indução transitória da expressão da enzima ecto- 5’NT/CD73 pela radioterapia também foi observada, sendo a adenosina gerada a responsável por contribuir na morte celular. O papel crucial da ecto-5’NT/CD73 na radiossensibilização das células foi confirmado pela inibição farmacológica e pelo uso do nocaute da enzima. Em conjunto, os resultados in vitro demonstraram que a vantagem da radioterapia parece ser alcançada naqueles pacientes que expressam o receptor P2X6 e a enzima ecto-5’NT/CD73 na área tumoral, podendo no futuro, ambos serem considerados possíveis marcadores para prever a eficácia da resposta à radioterapia para o tratamento do câncer de bexiga. Por fim, a realização do ensaio radiométrico frente à ecto-5’NT/CD73 evidenciou o potente efeito inibitório do ácido ursólico sobre esta enzima, cujo potencial também foi confirmado frente à linhagem celular T24.The urinary bladder is constantly exposed to potentially harmful substances in the urine, whose chronic exposure can lead to various diseases. Among these pathologies the hemorrhagic cystitis is a severe inflammatory condition of the bladder associated with the use of chemotherapeutic drugs, such as cyclophosphamide. It has been reported that long-term exposure to cyclophosphamide increases the risk of developing bladder cancer, which is characterized as being the second most common cancer of the urinary tract and the seventh most common cancer among men in the world. Alterations in the purinergic signaling have been shown in diseases associated with urinary bladder. In fact, the purinergic signaling has emerged as a potential target to be studied. Therefore, this thesis sought to evaluate the involvement of purinergic signaling in an in vivo model of hemorrhagic cystitis and in an in vitro model of bladder cancer. In order to identify preventive strategies and effective treatments to reduce morbidity and mortality associated with hemorrhagic cystitis, the Uncaria tomentosa species was investigated due to its wide use in cases of chronic inflammation and urinary tract diseases. From studies conducted in vivo, we demonstrated that systemic treatment with the quinovic acid glycosides purified fraction from U. tomentosa was able to prevent nociceptive and inflammatory events associated with hemorrhagic cystitis. The decreased expression of the P2X7 receptor was observed, most likely by the reduction of neutrophils migration to the site of inflammation. Therefore, this investigation has shown promising antiinflammatory properties for this fraction, which may in the future become a potential therapeutic agent for the treatment of this pathology. For bladder muscle invasive cancer, although radical cystectomy has been considered the standard treatment is still associated with significant morbidity. In an attempt to provide a better quality of life for patients, interest in therapeutic approaches aimed the preservation of the urinary bladder have increased. In this regard, the radiotherapy has been highlighted by being a treatment modality already used. Thus, we investigated the effects of radiation on the purinergic signaling in T24 human bladder cancer cell line. Among the receptors expressed by T24 cells, the P2X6 receptor showed significant increase after radiotherapy. From the analysis of patients with bladder cancer (Kaplan-Meier), we noticed the relationship between high expression of this receptor and increased survival rate. Following, the involvement of ectonucleotidases after irradiation exposure in T24 cell line was also evaluated. The purinergic signaling, mainly through hydrolysis of ATP to adenosine by the combined action of ectoenzymes, demonstrated important role in radiotherapy in vitro. The transient induction of ecto-5’NT/CD73 expression by radiotherapy was also observed, being the adenosine generated a possible responsible in T24 cell death. The crucial role of ecto-5’NT/CD73 in the radiosensitization of the cells was confirmed by pharmacological inhibition and the use of the enzyme knockout. Taken together, the in vitro results demonstrate that the benefit of radiation therapy appears to be achieved in those patients that express the P2X6 receptor and the enzyme ecto-5’NT/CD73 in the tumor area, and in the future both may be considered potential markers for predicting the effectiveness response to radiotherapy for the treatment of bladder cancer. Finally, the radiometric ecto-5’NT/CD73 assay showed the potent inhibitory effect of ursolic acid on this enzyme, whose potential was also confirmed through the T24 cell line