Loss-of-Function Mutations in LRRC6, a Gene Essential for Proper Axonemal Assembly of Inner and Outer Dynein Arms, Cause Primary Ciliary Dyskinesia

Primary ciliary dyskinesia (PCD) is a group of autosomal-recessive disorders resulting from cilia and sperm-flagella defects, which lead to respiratory infections and male infertility. Most implicated genes encode structural proteins that participate in the composition of axonemal components, such as dynein arms (DAs), that are essential for ciliary and flagellar movements; they explain the pathology in fewer than half of the affected individuals. We undertook this study to further understand the pathogenesis of PCD due to the absence of both DAs. We identified, via homozygosity mapping, an early frameshift in LRRC6, a gene that encodes a leucine-rich-repeat (LRR)-containing protein. Subsequent analyses of this gene mainly expressed in testis and respiratory cells identified biallelic mutations in several independent individuals. The situs inversus observed in two of them supports a key role for LRRC6 in embryonic nodal cilia. Study of native LRRC6 in airway epithelial cells revealed that it localizes to the cytoplasm and within cilia, whereas it is absent from cells with loss-of-function mutations, in which DA protein markers are also missing. These results are consistent with the transmission-electron-microscopy data showing the absence of both DAs in cilia or flagella from individuals with LRRC6 mutations. In spite of structural and functional similarities between LRRC6 and DNAAF1, another LRR-containing protein involved in the same PCD phenotype, the two proteins are not redundant. The evolutionarily conserved LRRC6, therefore, emerges as an additional player in DA assembly, a process that is essential for proper axoneme building and that appears to be much more complex than was previously thought

Mowat-Wilson syndrome in a Moroccan consanguineous family

Mowat-Wilson syndrome is a mental retardation-multiple congenital anomaly syndrome characterized by a typical facies, developmental delay, epilepsy, and variable congenital malformations, including Hirschsprung disease, urogenital anomalies, congenital heart disease, and agenesis of the corpus callosum. This disorder is sporadic and is caused by heterozygous mutations or deletions of the ZFHX1B gene located in the 2q22 region. We report here the first Moroccan patient, born to consanguineous parents, with Mowat-Wilson syndrome, due to a de novo, unreported mutation of the ZFHX1B gene

Mowat-Wilson syndrome in a Moroccan consanguineous family

Mowat-Wilson syndrome is a mental retardation-multiple congenital anomaly syndrome characterized by a typical facies, developmental delay, epilepsy, and variable congenital malformations, including Hirschsprung disease, urogenital anomalies, congenital heart disease, and agenesis of the corpus callosum. This disorder is sporadic and is caused by heterozygous mutations or deletions of the ZFHX1B gene located in the 2q22 region. We report here the first Moroccan patient, born to consanguineous parents, with Mowat-Wilson syndrome, due to a de novo, unreported mutation of the ZFHX1B gene

Mowat-Wilson syndrome in a Moroccan consanguineous family

Mowat-Wilson syndrome is a mental retardation-multiple congenital anomaly syndrome characterized by a typical facies, developmental delay, epilepsy, and variable congenital malformations, including Hirschsprung disease, urogenital anomalies, congenital heart disease, and agenesis of the corpus callosum. This disorder is sporadic and is caused by heterozygous mutations or deletions of the ZFHX1B gene located in the 2q22 region. We report here the first Moroccan patient, born to consanguineous parents, with Mowat-Wilson syndrome, due to a de novo, unreported mutation of the ZFHX1B gene

Isolation and Expression of the Human hPF20 Gene Orthologous to Chlamydomonas pf20

International audiencePrimary ciliary dyskinesia (PCD) is a heterogeneous congenital disorder characterized by bronchiectasis and chronic sinusitis, sometimes associated with situs inversus (i.e., Kartagener's syndrome) and male infertility. At the cell level, the disease phenotype includes various axonemal abnormalities of respiratory cilia and sperm flagella. We have previously isolated DNAI1, the first gene involved in these diseases in patients lacking outer dynein arms. In this study, designed to find additional genes for other axonemal defects, we report the isolation of a novel human gene, hPF20, which is orthologous to Chlamydomonas pf20. The hPF20 gene is expressed as two major transcripts: one is expressed in testis only, whereas the second is weakly expressed in many other tissues. As flagella of Chlamydomonas strains carrying pf20 mutations lack the axonemal central complexes, we tested the involvement of the hPF20 gene in the disease phenotype of five patients in whom cilia or flagella display abnormal central complexes. Five intragenic polymorphisms were identified and used to exclude hPF20 in two consanguineous patients, while no mutation was found in the remaining patients. However, given the genetic heterogeneity of PCD, we consider that this gene remains a good candidate to be investigated in patients with abnormal central complexes

SP-A restaure l’oligomérisation et la sécrétion de mutants de SFTPA1 et SFTPA2

National audienceIntroductionLa protéine A du surfactant (SP)-A est composée de SP-A1 et SP-A2 (codés respectivement par SFTPA1 et SFTPA2) oligomérisées en hexamères de SP-A1 et SP-A2. Les variants hétérozygotes de SFTPA1 et SFTPA2 sont associés à des fibroses et des adénocarcinomes pulmonaires. Cette étude a pour but d’analyser l’effet des variants de SFTPA1 et SFTPA2 sur la localisation subcellulaire, l’oligomérisation et la sécrétion de SP-A.MéthodesDes cellules HEK293T ont été co-transfectées de façon transitoire avec des vecteurs d’expression des ADNc de SFTPA1 ou SFTPA2 normaux (wt), mutés (m) ou vecteur vide (vv) selon les combinaisons suivantes : [SFTPA1_wt + vv], [SFTPA2_wt + vv], [SFTPA1_m + vv], [SFTPA2_m + vv], [SFTPA1_wt + SFTPA2_wt], [SFTPA1_wt + SFTPA1_m], [SFTPA1_wt + SFTPA2_m], [SFTPA2_wt + SFTPA2_m] ou [SFTPA2_wt + SFTPA1_m]. Plusieurs variants ont été testés. La localisation subcellulaire des protéines exprimées a été analysée par immunofluorescence (IF) après transfection dans des cellules HEK293. Le profil d’oligomérisation et la sécrétion ont été évalués par western blot (WB) des protéines du lysat cellulaire et du surnageant. La spécificité des interactions entre SP-A1 et SP-A2 a été vérifiée par co-immunoprécipitation (co-IP). Pour chaque expérience, des Tags différents ont été introduits dans les protéines recombinantes pour identifier les isoformes en jeu. RésultatsEn IF, les protéines SP-A2_wt sont décelables dans des vésicules de sécrétion alors que le marquage cellulaire associé aux protéines SP-A2_m est diffus dans le cytoplasme sans marquage vésiculaire. Cette observation confirme l’absence de sécrétion de SP-A2_m que nous avions précédemment rapportée. En WB, le profil d’oligomérisation de SP-A2_m est anormal avec la formation de tétramères sans hexamères décelables, et la sécrétion de SP-A2_m est absente. La co-transfection [SFTPA2_wt + SFTPA2_m] conduit à l’augmentation de l’expression de SP-A2_m, à la restauration des hexamères et d’une sécrétion pour deux des trois variants testés. Les mêmes résultats ont été retrouvés avec la co-transfection [SFTPA2_wt + SFTPA1_m]. La co-transfection [SFTPA1_wt + SFTPA2_m] conduit aussi à l’augmentation de l’expression de SP-A2_m, sans toutefois restaurer la formation des hexamères ni une sécrétion significative de SP-A2_m. Les mêmes résultats ont été retrouvés avec la co-transfection [SFTPA1_wt + SFTPA1_m]. Les expériences de co-IP ont par ailleurs confirmé la spécificité des interactions SP-A1/SP-A2. ConclusionCette étude révèle une interaction spécifique de SP-A1 et SP-A2 associée, lors de la co-expression avec SP-A2_wt, à une augmentation de l’expression de SP-A1_m ou SP-A2_m, mais aussi à la restauration d’un profil d’oligomérisation en hexamères et à une sécrétion de protéines du surfactant. Dans une perspective thérapeutique, ces résultats permettent d’envisager l’adjonction de SP-A2 exogène dans des modèles cellulaires surexprimant SP-A1_m ou SP-A2_m

WT SP-A restores abnormal oligomerization and secretion of mutant SFTPA1 and SFTPA2

International audienc

Hypomorphic pathogenic variant in SFTPB leads to adult pulmonary fibrosis

International audienceBiallelic pathogenic variants in the surfactant protein (SP)-B gene (SFTPB) have been associated with fatal forms of interstitial lung diseases (ILD) in newborns and exceptional survival in young children. We herein report the cases of two related adults with pulmonary fibrosis due to a new homozygous SFTPB pathogenic variant, c.582G>A p.(Gln194=). In vitro transcript studies showed that this SFTPB synonymous pathogenic variant induces aberrant splicing leading to three abnormal transcripts with the preservation of the expression of a small proportion of normal SFTPB transcripts. Immunostainings on lung biopsies of the proband showed an almost complete loss of SP-B expression. This hypomorphic splice variant has thus probably allowed the patients' survival to adulthood while inducing an epithelial cell dysfunction leading to ILD. Altogether, this report shows that SFTPB pathogenic variants should be considered in atypical presentations and/or early-onset forms of ILD particularly when a family history is identified

uORF-creating mutations in Van der Woude syndrome: why it is important to study 5’UTRs

International audienceBackground/Objectives:Van der Woude syndrome (VWS, MIM 119300) is an autosomal dominant cleft lip and/or palate with typical lower lip pits. Most patients carry loss-of-function mutations in IRF6. Upstream open reading frame (uORF)-creating mutations have been reported in four VWS patients. Pathogenic uORFcreating mutations are mostly out-of-frame upstream start codons (uAUG) in the 5’UTR. We searched for IRF6 uORF mutations and assessed the ability to predict the pathogenicity of uORFcreating variations of 5 prediction tools.Methods:We analyzed IRF6 UTR and coding regions in 68 VWS probands. By using a set of 44 reference genes, we assessed 5 in silico tools predicting the probability of ATGs to initiate translation: NetStart, ATGpr, TIS Miner, AltORFev, TIS Predictor. We then assessed the potential pathogenicity of all the theoretical uORFs in IRF6 5’UTR.Results:We have identified two novel uORF-creating mutations (c.-141C>T and c.-162C>T), representing 3% (2/68) of the probands. The 7 carriers of the two families had typical VWS signs. Our in silico analyses revealed a higher accuracy for AI-based tools over those based on Kozak consensus scoring. There are 28 theoretical uAUG-creating SNVs in IRF6 5’UTR. With AI-based tools, the six uAUG identified in VWS patients have high translation initiation site scores; 3 to 4 of the theoretical uAUG-creating SNVs had high scores and could correspond to pathogenic mutations. For the dozen of theoretical SNVs with intermediate scores, predicting pathogenicity remains challenging.Conclusion:As untranslated regions are frequently understudied in NGS strategies, uORF-creating mutations may be underdiagnosed in VWS and in human pathology in general

SPA restaure l’oligomérisation et la sécrétion de mutants de SFTPA1 et SFTPA2

National audienceIntroductionLa protéine du surfactant (SP)-A mature, sécrétée dans l’espace alvéolaire, est une combinaison de SP-A1 et SP-A2 principalement rapportée sous forme d’octadécamères. Les variations hétérozygotes dans les gènes codant pour SP-A (SFTPA1 et SFTPA2) sont associées à des pneumopathies interstitielles diffuses (PID) fibrosantes et des adénocarcinomes pulmonaires. À ce jour aucun traitement spécifique n’existe. Cette étude a pour but d’analyser l’effet des mutants SP-A1 et SP-A2 sur l’oligomérisation et la sécrétion ainsi que le potentiel thérapeutique de SP-A.MéthodesÉtude in vitro par expression ou co-expression transitoire de SP-A WT et/ou mutée (mutation faux sens) dans la lignée cellulaire HEK293T. Les protéines extraites du lysat cellulaire et du surnageant (sécrétion) sont analysées par western blot et co-immunoprécipitation (co-IP). Les protéines sont également étudiées par immunofluorescence.RésultatsLes protéines SP-A mutées présentent un profil d’oligomérisation anormal dans le lysat soluble avec une absence d’hexamère en comparaison au WT. De façon intéressante, la co-expression avec SP-A WT augmente la quantité de SP-A mutée et restaure la formation d’hexamères. Parallèlement, dans le lysat insoluble, SP-A mutée seule est plus présente qu’en étant co-exprimée avec du WT. Cette observation est en faveur d’une solubilisation de SP-A mutée en présence de WT. Nous avons précédemment montré que SP-A mutée n’était pas sécrétée. Cette étude confirme ces observations également par immunofluorescence mettant en évidence des vésicules de sécrétion seulement pour SP-A WT. Là encore, la co-expression avec SP-A WT permet à nouveau d’observer une sécrétion partielle des protéines mutées. Les analyses par co-IP du lysat et du surnageant ont permis de confirmer l’interaction entre SP-A WT et SP-A mutée.ConclusionNous rapportons pour la première fois à travers cette étude le bénéfice de la protéine SP-A WT dans la restauration du profil d’oligomérisation et de la sécrétion des protéines SP-A mutées. Cette étude pilote permet d’envisager l’étude de SP-A comme traitement des patients présentant une fibrose pulmonaire associée à des variations de SFTPA1 ou SFTPA2