Identification of liver protein targets modified by tienilic acid metabolites using a two-dimensional Western blot-mass spectrometry approach

International audienceA combined approach based on two-dimensional electrophoresis-immuno-blotting and nanoliquid chromatography coupled on-line with electrospray ionization mass spectrometry (nLC-MS/MS) was used to identify proteins modified by a reactive intermediate of tienilic acid (TA). Liver homogenates from rats exposed to TA were fractionated using ultra centrifugation; four fractions were obtained and subjected to 2D electrophoresis. Following transfer to PVDF membranes, modified proteins were visualized after India ink staining, using an anti-serum raised against TA and ECL detection. Immuno-reactive spots were localized on the PVDF membrane by superposition of the ECL image, protein spots of interest were excised, digested on the membrane with trypsin followed by nLC-MS/MS analysis and protein identification. A total of 15 proteins were identified as likely targets modified by a TA reactive metabolite. These include selenium binding protein 2, senescence marker protein SMP-30, adenosine kinase, Acy1 protein, adenosylhomocysteinase, capping protein (actin filament), protein disulfide isomerase, fumarylacetoacetase, arginase chain A, ketohexokinase, proteasome endopeptidase complex, triosephosphate isomerase, superoxide dismutase, dna-type molecular chaperone hsc73 and malate dehydrogenase

Etude sur la biosynthèse de Naphtoquinones végétales et bactériennes

Quinones are well dispached in nature, in the animal, vegetal and microbial kindom. Those compounds are synthesized from a small number of simple intermediates. The naphtho-quinone ring can be synthesized from four precusrsors: acetate, toluquinone, p-hydroxy-benzoate and shikimate. The aim of this work is the study of vegetal or bacterial naphthoquinone biosynthesis from shikimic acid (trihydroxy-3,4,5 cyclohexen-1 carboxylic acid), and the search for intermediates in this biosynthetic pathway. At the start of our study no experimental data were available and its development was connected to parallel studie from other teams. Some preliminary results had proposed that shikimic acid was a common precursor of aromatic amino-acid, dihydroxy-3,4-benzoic acide, p-amino-benzoic acid, p-hydroxybenzoic acid and menaquinone from Eschericia coli. Thus at the start of this work we know that shikimic acid is totally incorporated in bacterial menaquinones so that the carboxyle becomes a carbonyle of the quinone. Thus three questions need to be answered: - How does the quinonic ring form: where is the carboxylic carbon? - From which precursor commes the three missing carbons? - Is shikimic acid incorporated in the naphtha-quinone symmetrically or selectively? The first question was solved both by Leistner and Zenk and by Leduc et al. in our laboratory using [1,6-14C] shikimic acid. This method implicates laborious and complex degradation of the formed quinines. We have synthesized [3H-3] shikimic acid specifically labeled in a position allowing a simple and univocal degradation. A partial answer to the second question was obtained by Campbell who showed incorporation of three atoms (2,3 and 4) of glutamate into the quinone ring. From his results and the belief that chorismic acid was a precursor we postulated OSB (ortho-succinoyl-benzoic acid), and could synthesize it and prove its incorporation in the naphtoquinones studied (menaquinone, lawsone and juglone). The work in presented in six chapters: the first describes the synthesis of radioactive precursors. The second describes the methods of incorporation of radioactive precursor into quinones, their isolation and their degradation. The three following chapter report the results of incorporation into menaquinone, vegetal naphthoquinones and vegetal anthraquinones. The six chapter discuss the results and proposes a general scheme for shikimic acid derived quinone biosynthesis. At the end an experimental part and some technical add-on are presented.Les quinones sont des composés largement répandus dans la nature, aussi bien dans le règne végétal, qu'animal ou microbien. Ces molécules sont biosynthétisées à partir d'un petit nombre d'intermédiaires simples. Le noyau des naphtoquinones, en particulier, peut être synthétisé à partir de quatre précurseurs principaux l'acétate, la toluhydroquinone, le p-hydroxybenzoate et le shikimate. L'objet du présent travail est l'étude de la biosynthèse des naphtoquinones végétales ou bactériennes dérivant de l'acide shikimique (acide trihydroxy-3,4,5 cyclohexène-1 carboxylique), et la recherche des intermédiaires de cette voie de biosynthèse. Etant donné, à l'origine, l'absence quasi-totale de résultats expérimentaux dans ce domaine et le développement important qu'il a acquis en même temps que nous commencions notre travail, celui-ci a été constamment lié dans son développement aux données les plus récentes parues dans la littérature. Quelques études antérieures avaient montré que l'acide shikimique devait être le précurseur commun des acides aminés aromatiques et de plusieurs facteurs de croissance aromatiques (acide dihydroxy-2,3 benzoique, dihydroxy-3,4 benzoique, p-aminobenzoique et p-hydroxybenzoique) ainsi que de la ménaquinone de Escherichia coli (16,17). Lorsque nous commençons ce travail, on sait seulement que l'acide shikimique est incorporé in toto dans les ménaquinones bactériennes, de telle sorte que son carboxyle devient un des carbonyles de la quinone. Trois questions se posent alors: - Sur lequel des carbones 2 ou 6 adjacents au carboxyle, le cycle naphtoquinonique se ferme-t-il ? - Quelle est la molécule qui fournit les trois carbones nécessaires à la fermeture du cycle quinonique de la naphtoquinone, et quel est le mécanisme de cette fermeture ? - Le cycle naphtoquinonique ainsi formé est-il incorporé de façon symétrique ou non dans les ménaquinones, c'est-à-dire le carboxyle de l'acide shikimique est-il incorporé indifféremment dans les deux carbonyles quinoniques, ou sélectivement dans l'un des deux ? Pour résoudre la première question, LEISTNER et ZENK d'une part et M. LEDUC dans notre laboratoire d'autre part, ont utilisé l'acide shikimique [14 C-1,6]. Cette méthode nécessite une dégradation laborieuse des quinones formées. Nous avons, quant à nous, synthétisé un acide shikîmique [3H-3] marqué au tritium en une position spécifique, ce qui permet une dégradation simple et univoque. Une réponse partielle à la deuxième question a été donnée par CAMPBELL. Il montrait, en 1969, que le glutamate est capable d'apporter ses carbones 2, 3 et 4 pour la fermeture du cycle naphtoquinonique, mais il ne disposait pas alors des résultats de notre laboratoire lui permettant d'induire correctement le mécanisme de cette biosynthèse. Nous avons pu postuler la formation d'un intermédiaire, I'acide ortho-succinoylbenzoique OBS, dont nous avons pu prouver l'existence par synthèse et incorporation dans les quinones étudiées . L'existence de cet intermédiaire et la possibilité que nous avons eue de réaliser sur l'OSB différents marquages spécifiques nous ont permis de répondre à la troisième question, à savoir, l'incorporation orientée ou non de l'OSB dans les quinones. En même temps, différentes équipes montraient que d'autres quinones existant dans les végétaux telles que la lawsone, la juglone et différentes anthraquinones dérivaient aussi de l'acide shikimique; il nous a semblé intéressant d'appliquer nos techniques à l'étude très voisine de la biosynthèse de ces quinones. Pour la clarté de l'exposé, nous présentons dans le premier chapître les méthodes de synthèse des précurseurs radioactifs, dans le deuxième, les méthodes d'isolement et de dégradation des quinones. Les trois chapîtres suivants rapportent l'incorporation dans les ménaquinones, les naphtoquinones végétales et les anthraquinones végétales. Dans le sixième chapître, nous discutons nos résultats et proposons un schéma général de biosynthèse des quinones dérivant de l'acide shikimique. La partie expérimentale de ce travail est rassemblée après l'exposé théorique

Les inhibiteurs "suicides" des Cytochromes P450 (établissement d'une banque de données, mise au point d'un test de screening et études structures-activité concernant des substrats furaniques du CYP 3A4)

PARIS5-BU Saints-Pères (751062109) / SudocSudocFranceF

Sulfenic acids as reactive intermediates in xenobiotic metabolism

Sulfenic acid reactive intermediates are formed during the oxidation of cysteine residues of proteins and play key roles in enzyme catalysis, redox homeostasis and regulation of cell signalling. However few data are presently available on the formation and fate of sulfenic acids as reactive intermediates during the metabolism of xenobiotics. This article is a review of the xenobiotic metabolism situations in which the intermediate formation of a sulfenic acid has been reported. Formation of these intermediates has been either proposed on the basis of the isolation of products possibly deriving from sulfenic acids or shown after trapping of the sulfenic acid by specific nucleophiles. This review indicates the different mechanisms by which a sulphur-containing xenobiotic can be metabolized with the intermediate formation of a sulfenic acid. It also indicates the different possible fates of these sulfenic acids that have been reported in the literature. Finally, it discusses the possible implications of the formation of xenobiotic derived sulfenic acid reactive metabolites in pharmacology and toxicology

In vitro activities of antimicrobial combinations against clinical isolates of Stenotrophomonas maltophilia

International audienceMetabonate are false metabolites: after fortuitous introduction of small amount of ammonium (present in recent glucose-6-phosphate dehydrogenase commercial preparations) a series of new amide metabonates was found in the P450 catalyzed transformation of several thiolactones (thiolenones) and thioesters in place of the corresponding acids normal metabolites. Other amines like Tris buffer also lead to anormal Tris-subtituted amides.Les Métabonates sont des faux métabolites dus à des réactions parasites: après introduction fortuite d'une petite quantité d'ammonium (présent dans les lots récents de préparations commerciales de glucose-6-phosphate déhydrogénase) nous avons trouvé de nouveaux métabonates amides lors de la transformation catalysée par les P450 de plusieurs thiolactones (thiolènones) et thioesters en plus des métabolites acides normaux. D'autres amines comme le tampon Tris donnent aussi des métabonates amides Tris-substitués

Mechanism of H 2 S Formation from the Metabolism of Anetholedithiolethione and Anetholedithiolone by Rat Liver Microsomes

International audienceThe drug anetholedithiolethione, ADT, and its analogs have been extensively used as H2S donors. However, the mechanism of H2S formation from ADT under biological conditions remains almost completely unknown. This article shows that incubation of ADT or its metabolite anetholedithiolone, ADO, with rat liver microsomes, leads to H2S in the presence of NADPH and O2, and that H2S formation is greatly inhibited by N-benzyl-imidazole, indicating that this formation is mainly catalyzed by cytochrome P450-dependent monooxygenases. It also shows that there is a concomitant formation of H2S and para-methoxy-acetophenone, pMA, during microsomal metabolism of ADT and ADO. This article shows for the first time that ADO is a better H2S donor than ADT under those conditions, and proposes first detailed mechanisms for the formation of H2S from the microsomal metabolism of ADT and ADO