The bifunctional transporter-receptor IRT1 at the heart of metal sensing and signalling

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Caractérisation biochimique du transporteur IRT1 et de son mécanisme de régulation

Le fer est un nutriment clé pour tous les organismes vivants et il est impliqué dans de nombreux processus cellulaires. Bien qu'il soit l'un des éléments les plus abondants sur terre, le fer est souvent indisponible car il précipite dans le sol, formant des complexes insolubles. Les plantes absorbent le fer du sol à travers les cellules épidermiques de la racine en utilisant le transporteur de fer IRT1 qui appartient à la famille de transporteurs ZIP largement répandue. Outre le fer, l'IRT1 peut également transporter des métaux non ferreux (Zn, Mn, Co et Cd), que nous appelons également les substrats secondaires. Notre équipe a récemment montré que l'IRT1 agit comme un transcepteur, détectant directement les métaux non ferreux à l'aide d'un motif riche en histidine dans une boucle intracellulaire non structurée (Dubeaux et al., 2018). Brièvement, sous un excès de métal non ferreux, les métaux se lient aux histidines recrutant la kinase CIPK23. La phosphorylation, à son tour, permet le recrutement de la ligase IDF1 E3 qui ubiquitine IRT1 et la cible pour la dégradation par la voie endocytique. À ce jour, nous en savons encore très peu sur les caractéristiques structurelles de l'IRT1, ses mécanismes de transport, la base de la sélectivité de transport de l'IRT1 et les mécanismes moléculaires à l'origine des événements de régulation tels que le recrutement de la kinase CIPK23. Un tel écart existe pour toutes les ZIP eucaryotes. Au cours de ce travail, nous avons initié des étapes cruciales pour réaliser la caractérisation biochimique de cette protéine. Ici, nous sommes les premiers à rapporter avoir établi un protocole optimisé pour l'expression hétérologue, la solubilisation et la purification d'une protéine variante IRT1 dans les cellules de levure. En outre, nous avons déterminé une procédure technique pour l'étude du transporteur IRT1 dans les protéoliposomes. Les deux approches techniques rapportées ici ont jeté les bases de l'avenir de la caractérisation structurelle et mécanique de l'IRT1 et des ZIP eucaryotes en général. L'échantillon généré par notre protocole a abouti à une qualité suffisante pour la caractérisation préliminaire de la structure par microscopie électronique cryogénique en collaboration avec nos collaborateurs. De plus, nous avons pu étudier les propriétés oligomères de l'IRT1 in vitro, en soumettant l'échantillon pur à une chromatographie d'exclusion de taille couplée par fluorescence et à une ultracentrifugation analytique, et par des techniques in vivo telles que la co-immunoprécipitation et la complémentation de fluorescence bimoléculaire. En outre, nous avons étudié la nature du mécanisme moléculaire induit par la liaison du métal sur la boucle de l'IRT1. Nous avons déterminé par dichroïsme circulaire et RMN l'absence de structure tridimensionnelle sur ladite partie de la protéine, même en présence des substrats secondaires qui déclenchent la voie régulatrice de l'IRT1. Nous fournissons ici, des preuves supplémentaires de la liaison des métaux sur la boucle de l'histidine, ainsi qu'une quantification de cette interaction in vitro. De plus, nous avons déduit le rôle d'un résidu d'acide aspartique, également présent dans la boucle de régulation, qui semble avoir un rôle majeur dans la stabilité structurelle de l'IRT1, mais aucun sur la liaison directe du métal.Iron is a key nutrient for all living organisms and it is involved in many cellular processes. Despite being one of the most abundant elements on earth, iron often is unavailable because it precipitates in soil, forming insoluble complexes. Plants take up iron from the soil through the epidermic cells of the root using the IRT1 iron transporter that belongs to the widely distributed ZIP family of transporters. Aside from iron, IRT1 can also transport non-iron metals (Zn, Mn, Co and Cd), which we also refer to as the secondary substrates. It was recently shown by our team that IRT1 acts as a transceptor, directly sensing non-iron metals using a histidine-rich stretch in an unstructured intracellular loop (Dubeaux et al., 2018). Shortly, under non-iron metal excess, metals bind to the histidines recruiting the CIPK23 kinase. Phosphorylation, in turn, allows the recruitment of the IDF1 E3 ligase that ubiquitinates IRT1 and targets it for degradation through the endocytic pathway. To date, we still know very little about the structural characteristics of IRT1, its transport mechanisms, the basis of IRT1 transport selectivity and the molecular mechanisms driving regulation events such as the recruitment of the CIPK23 kinase. Such a gap exist for all the eukaryotic ZIPs. During the course of this work, we initiated crucial steps for achieving the biochemical characterization of this protein. Here, we are the first to report having established an optimized protocol for the heterologous expression, solubilization and purification of an IRT1 variant protein in yeast cells. Also, we determined a technical procedure for the study of the IRT1 transporter in proteoliposomes. Both technical approaches reported here set ground in the future of the structural and mechanical characterization of IRT1, and eukaryotic ZIPs in general. The sample generated by our protocol resulted in a quality enough for preliminary characterization of the structure by cryogenic electron microscopy together with our collaborators. Additionally, we were able to investigate the oligomeric properties of IRT1 in vitro, by subjecting the pure sample to fluorescent coupled size exclusion chromatography and analytical ultracentrifugation, and by in vivo techniques such as co-immunoprecipitation and bimolecular fluorescence complementation. Furthermore, we investigated the nature of the molecular mechanism driven by metal binding on the loop of IRT1. We determined by circular dichroism and NMR the absence of tridimensional structure on said portion of the protein, even in presence of the secondary substrates that trigger the regulatory path of IRT1. We provide here, further evidence of metal binding on the histidine loop, as well as a quantification of this interaction in vitro. Additionally, we inferred on the role of an aspartic acid residue, present in the regulatory loop as well, which appears to have a major role in the structural stability of IRT1, but none on the direct metal binding

Differential metal sensing and metal‐dependent degradation of the broad spectrum root metal transporter <scp>IRT1</scp>

SUMMARYIron is an essential micronutrient for plant growth and development. Under low iron conditions, Arabidopsis plants take up soil iron using the root iron transporter IRT1. In addition to iron, IRT1 also transports others divalent metals, including cadmium, which consequently accumulates into plant tissues and enters the food chain. IRT1 expression was shown to be regulated at the transcriptional and post‐translational levels by its essential metal substrates to maximize iron uptake while limiting the accumulation of zinc, manganese, or cobalt. Here, we characterized the regulation of IRT1 by cadmium. A short‐term exposure to cadmium decreased the cell surface levels of IRT1 through endocytosis and degradation, but with a lower efficiency than observed for other IRT1 metal substrates. We demonstrated that IRT1 endocytosis in response to cadmium is mediated through the direct binding of cadmium to histidine residues within the regulatory loop of IRT1. However, we revealed that the affinity of the metal sensing motif is much lower for cadmium compared to other metal substrates of IRT1. Finally, we proved that cadmium‐induced IRT1 degradation takes place through ubiquitin‐mediated endocytosis driven by the UBC35/36 E2 ubiquitin‐conjugating enzymes and the IDF1 E3 ubiquitin ligase. Altogether, this work sheds light on the mechanisms of cadmium‐mediated downregulation of IRT1 and provides an additional molecular basis for cadmium accumulation and toxicity in plants.</jats:p

Oral tolerance in antigen induced arthritis (AIA) in rabbits by administration of articular cartilage hydrolysate

La artritis reumatoide es una patología autoinmune caracterizada por inflamación poliarticular, tumefacción e inflamación que afecta a más del 1% de la población mundial. La patobiología de la artritis reumatoide involucra varias poblaciones celulares como linfocitos T, B, macrófagos y fibroblastos, así como una compleja interacción de citoquinas proinflamatorias. Las actuales terapias convencionales y biológicas no siempre funcionan o producen solo una mejora parcial. La tolerancia inmunológica es un mecanismo por el cual el sistema inmune previene la autorreactividad. El objetivo de este estudio piloto fue evaluar la eficacia de péptidos provenientes de un hidrolizado enzimático de cartílago articular extraído del tarso bovino (HCA) para el tratamiento de artritis reumatoide en un modelo de artritis reumatoide (AAE) en conejos. Los animales AAE presentaron inflamación y dolor dentro del primer mes de la inmunización primaria que fue revertida en el grupo AAE + HCA. El grupo control mostró un tejido sinovial normal sin afecciones de ningún tipo. El grupo AAE reveló un proceso inflamatorio severo con hiperplasia sinovial, infiltrado de linfocitos y proliferación vascular. El grupo tratado redujo la inflamación, proliferación linfocítica y neoangiogénesis significativamente. Los conejos artríticos incrementaron significativamente los niveles marcadores inflamatorios como óxido nítrico, interferon γ (INF-γ) y factor de necrosis tumoral α (TNF- α) respecto del control y redujeron significativamente los niveles de interleukina 4 (IL-4). El tratamiento mostró una reducción significativa de óxido nítrico, IFN-γ y TNF-α y un aumento de IL-4. Este trabajo sugiere que esta terapia podría resultar útil en el aspecto clínico y en los parámetros bioquímicos y podría inhibir específicamente la respuesta inmune. Futuros estudios con mayor número de animales y otros parámetros de laboratorio complementarios podrán brindar evidencias en este sentido.Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease characterized by polyarticular inflammation, swelling and inflammation that affects more than 1% of the world population. The pathobiology of rheumatoid arthritis involves several cell populations as T lymphocytes, B, macrófagosy fibroblasts, and a complex proinflammatory cytokines interactions. Conventional and biologic therapies do not always work or produce only a partial improvement. Immunological tolerance is a mechanism by which the immune system prevents autoreactivity. The aim of this pilot study was to evaluate the efficacy of peptides from an from articular cartilage hydrolysate extracted of tarsus (HCA) for the treatment of rheumatoid arthritis in a model of rheumatoid arthritis (AAE) in rabbits. AAE animals showed inflammation and pain within de first month of the primary immunization that was reversed in the AAE + HCA group. The control group showed a normal unnaffected synovial tissue. The AAE group revealed an inflamatory process whith synovial hyperplasia, filtering in lymphocytes and vascular proliferation. The treated group decreased significantly inflammation, lymphocyte proliferation and angiogenesis. Arthritic rabbits increased the levels in flammatory markers as nitric oxide, interferon gamma (INF-ɣ) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) compared to control and significantly reduced levels of interleukin 4 (IL-4). The treatment showed a significant reduction of nitricoxide, IFN-gamma and TNF-alpha and an increase in IL-4. This work suggests that this therapy may be useful in the clinical aspect and the biochemical and immune parameters. Future studies with larger numbers of animals and other laboratory parameters may provide additional evidence in this regard.Fil: Abramson, David. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Cabello, Julieta Virginia. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Bumaguin, Gaston E. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Jamin, Alexis. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Vitelli, Ezequiel J.. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Zingoni, Leandro. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Sarrio, Leandro. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Feldman, Sara. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Laboratorio de Biología Osteoarticular, Ingeniería Tisular y Terapias Emergentes; ArgentinaFil: Cointry, Gustavo Roberto. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas. Centro de Estudios de Metabolismo Fosfocálcico; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin