A mikrobiális flóra epidermális barrier funkcióra gyakorolt hatása in vitro tenyésztett keratinocitákban

Az emberi bőr egyik funkciója az, hogy megvédje a szervezetet a patogén kórokozóktól és a káros környezeti hatásoktól. Ismert, hogy bőrünk felszínén különböző baktériumok és mikrobák által kialakított úgynevezett kommenzális flóra található. Az viszont kevésbé ismert, hogy ezen mikrobiális flóra milyen hatással van a humán epidermális sejtekre és a bőr homeosztázisára. Célunk annak a megismerése volt, hogy a kommenzális flóra egy tagja a Propionibacterium acnes (P.acnes) baktérium törzs hatással van-e az epidermális barrier funkciójára. Ezen vizsgálatok elvégzéséhez humán papilloma vírussal immortalizált keratinocita (HPV-KER) sejteket kezeltünk különböző dózisú és eltérő filogenetikai csoportba tartozó P.acnes baktérium törzsekkel (889, 6609, ATCC11828), majd vizsgáltuk a barrier funkció változását valós időben az xCELLigence rendszert alkalmazva. Az eredményeink arra utalnak, hogy baktérium kezelés hatására dózisfüggő változások indulnak, melyek mértéke eltér a különböző baktérium törzsek között. Azt is vizsgáltuk, hogy baktérium kezelés hatására változik-e a konfluens monolayer HPV-KER sejt kultúrában a claudin 1,2,4 (CLDN 1,2,4), az occludin (OCL1) és a zonula occludens (ZO1) tight junction fehérjék mRNS szintű kifejeződése. Az általunk használt sejtekben a vizsgált gének közül a CLDN2 és 4 nem volt kimutatható mRNS szinten. A CLDN1 mRNS szintű kifejeződése csökkent, míg az OCL1 és a ZO1 szintje emelkedett baktérium kezelés hatására. A P.acnes baktérium hatására veleszületett immun és gyulladásos folyamatok indulnak a keratinocita sejtekben. Ezért a sejteket TNF gyulladásos citokinnel (1, 5, 10g/ml) kezeltük és vizsgáltuk a barrier funkcióra gyakorolt hatását. Azt tapasztaltuk, hogy TNF kezelés, ezáltal a gyulladásos folyamatok hatására meglazulhat az epidermális barrier szerkezete, mely lehetővé teszi, hogy a baktérium által szekretált anyagok eljussanak a mélyebb szöveti rétegekbe. Ezen eredmények alapján feltételezhető, hogy a mikrobiom hatással lehet a bőr barrier funkciójára. Valamint hogy ezen események fontos szerepet játszhatnak számos különböző bőrbetegség patogenezisében

Propionibacterium acnes-indukálta TLR szignál folyamatok negatív szabályozóinak azonosítása és jellemzése keratinocitákban

A Propionibacterium acnes (P. acnes) tagja az egészséges bőr mikroflórájának, azonban bizonyos körülmények között patogén faktorként is viselkedhet különböző betegségek kialakulásában, mint az acne vulgaris patogenezise során. Ismert, hogy humán epidermális keratinociták a baktérium hatására veleszületett immun és gyulladásos folyamatokat indítanak a patogénfelismerő Toll-like receptorok (TLR) aktiválásán keresztül. Kevésbé ismert ezen folyamatok negatív szabályozása, mely a folyamatok lecsendesítése révén véd a szabályozatlan, gyakran destruktív jellegű gyulladás kialakulásától. Munkánk során ezért célul tűztük ki már más rendszerekben leírt, a TLR szignálfolyamatok negatív szabályozó elemeinek (SIGIRR, TOLLIP, TNIP1 és TNFAIP3) azonosítását és jellemzését in vitro tenyésztett humán keratinocitákban (HPV-KER). Ezen szabályozók mRNS szintű kifejeződését és ezek változását különböző filogenetikai csoportba tartozó P. acnes 889 és 6609 baktériumtörzs hatására valós idejű RT-PCR módszerrel detektáltuk, fehérjeszintű vizsgálatainkat western blot analízissel végeztük. Vizsgálva az NF-κB transzkripciós faktor aktivációját azt tapasztaltuk, hogy baktériumkezelés hatására az NF-κB mennyisége dózisfüggő módon nőtt a sejtmagban, ami a P. acnes hatására induló dózisfüggő TLR aktivációra utal. Eredményeink azt mutatják, hogy mind a négy vizsgált negatív szabályozó mRNS szinten kifejeződik HPV-KER sejtekben. Ezen felül a TNIP1 és a TNFAIP3 expressziója gyors, tranziens módon emelkedik P. acnes kezelés hatására. A baktérium dózisának emelésével párhuzamosan dózisfüggő módon fokozódik mindkét gén mRNS szintű kifejeződése. Ezen folyamatok hátterében az NF-κB dózisfüggő aktivációja és nukleáris transzlokációja állhat. Míg a TOLLIP mennyisége csökken, addig a TNFAIP3 nő fehérjeszinten a baktérium mennyiségének emelésével. A különböző klinikai izolátumú P. acnes törzsek hatásában nem találtunk különbséget a negatív szabályozók kifejeződésére. Eredményeink arra utalnak, hogy keratinocitákban a P. acnes mennyiségétől függően dózisfüggő TLR aktiváció következik be. Ezen felül a bőrsejtekben is kifejeződnek a TLR szignálfolyamatokat negatívan szabályozó molekulák, melyeknek a gyulladásos folyamatok kontrollálása révén fontos szerepük lehet a bőrsejtek és a kommenzális flóra elemei közötti egyensúly fenntartásában

Cutibacterium acnes regulates the epidermal barrier properties of HPV-KER human immortalized keratinocyte cultures

Our skin provides a physical barrier to separate the internal part of our body from the environment. Maintenance of complex barrier functions is achieved through anatomical structures in the skin, the stratified squamous epithelium specialized junctional organelles, called tight junctions (TJs). Several members of our microbial communities are known to affect the differentiation state and function of the colonized organ. Whether and how interactions between skin cells and cutaneous microbes, including Cutibacterium acnes (C. acnes), modify the structure and/or function of our skin is currently only partly understood. Thus, in our studies, we investigated whether C. acnes may affect the epidermal barrier using in vitro model systems. Real-time cellular analysis showed that depending on the keratinocyte differentiation state, the applied C. acnes strains and their dose, the measured impedance values change, together with the expression of selected TJ proteins. These may reflect barrier alterations, which can be partially restored upon antibiotic-antimycotic treatment. Our findings suggest that C. acnes can actively modify the barrier properties of cultured keratinocytes, possibly through alteration of tight cell-to-cell contacts. Similar events may play important roles in our skin, in the maintenance of cutaneous homeostasis

Factors shaping the composition of the cutaneous microbiota

From our birth, we are constantly exposed to bacteria, fungi and viruses, some of which are capable of transiently or permanently inhabiting our different body parts as our microbiota. The majority of our microbial interactions occur during and after birth, and several different factors, including age, sex, genetic constitution, environmental conditions and life style, have been suggested to shape the composition of this microbial community. Propionibacterium acnes (P. acnes) is one of the most dominant lipophilic microbes of the postadolescent, sebum-rich human skin regions. Currently, the role of this bacterium in the pathogenesis of the most common inflammatory skin disease acne vulgaris is a topic of intense scientific debate. Recent results suggest that Westernization strongly increases the dominance of the Propionibacterium genus in human skin compared to natural populations living more traditional lifestyles. According to the disappearing microbiota hypothesis proposed by Martin Blaser a few years ago, such alterations in the composition of our microbiota are the possible consequences of socioeconomic and lifestyle changes occurring after the industrial revolution. Evanescence of species that were important elements of the human ecosystem might lead to the overgrowth and subsequent dominance of others because of the lack of ecological competition. Such changes can disturb the fine-tuned balance of the human body and, accordingly, our microbes developed through a long co-evolutionary process. These processes might lead to the transformation of a seemingly harmless species into an opportunistic pathogen through bacterial dysbiosis. This might have happen in the case of P. acnes in acne pathogenesis

A keratinociták, szebociták, és a Propionibacterium acnes baktérium közötti kölcsönhatások in vitro modellezése

Bőrünk jellegzetes mikrobiális flórával rendelkezik, mely a bőr felső rétegeiben, illetve a piloszebáceus egység (follikulus) területén helyezkedik el. Az itt található sejtek (keratinociták, szebociták) valamint a mikróbák közötti komplex kölcsönhatás jelentős szerepet játszik a bőr egészséges funkcióinak kialakításában. Ennek felborulása különböző bőrbetegségek, mint például az acne vulgaris kialakulását eredményezi, mely folyamatokban fontos szerepet játszik a bőr mikrobiom prominens tagja, a Propionibacterium acnes (P. acnes) baktérium. Munkánk során célunk egy olyan in vitro modell kialakítása és tesztelése, mely lehetővé teszi a keratinociták, a szebociták és a P. acnes közötti komplex kölcsönhatás in vitro modellezését. Ehhez egy olyan kísérleti rendszer kialakítását kezdtük, melyben a keratinocitákat és a szebocitákat egy poliészter membránnal térben elválasztott transwell rendszerben együtt tenyésztjük, ami azonban lehetővé teszi oldott kismolekulák diffúzióját a kamrák között. A keratinociták P. acnes kezelését követően valós idejű RT-PCR módszerrel követjük a baktérium hatására gyulladásos citokin mRNS-ek (TNFα, IL-1α) kifejeződésének változását a két sejttípusban, valamint Oil red O festéses a szebociták faggyútermelésének változásait. Eredményeink azt mutatják, hogy mindkét citokin kifejeződése már 6 órával a baktérium kezelést követően fokozódik a P. acnes közvetlen hatására keratinocitákban. Ugyan a szebociták közvetlenül nem érintkezhetnek a baktériumokkal, ezekben a sejtekben is jellegzetes transzkripciós változások detektálhatóak. Emellett, Oil red O festés eredményei alapján a 48 órás mintákban a szebociták fokozott faggyútermelését is megfigyeltük. Eredményeink alapján a follikulusokban a keratinociták közvetlenül érintkeznek az itt élő mikrobiális flóra különböző tagjaival. Ennek hatására patogénfelismerő receptorok aktivációja révén veleszületett immun-, és gyulladásos folyamatok indulnak. Keratinocita és/vagy bakteriális eredetű szekretált molekulák révén azonban a szebocitákban is hasonló folyamatok indulhatnak és faggyútermelésük is fokozódik, annak ellenére, hogy immunhisztokémiai vizsgálatok eredményei alapján ezek a sejtek közvetlenül nem érintkeznek a baktériumokkal a piloszebáceus egységben sem. Eredményeink a bőr sejtjei és a mikrobiom elemei között fennálló komplex kölcsönhatás meglétét támasztják alá

Propionsav szerepének vizsgálata a Propionibacterium acnes patogenicitásában

A Propionibacterium acnes (P. acnes) a bőr természetes mikroflórájának tagja, de speciális körülmények között opportunista patogénként hozzájárul gyulladásos bőrbetegségek kialakulásához. Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján ismert, hogy különböző filogenetikai alcsoportokba tartozó P. acnes izolátumok (889, 6609, ATCC 11828) HPV-KER keratinocita sejtek sejtbiológiai sajátságaira gyakorolt hatása törzs- és dózis-specifikus sajátságokat mutat. Magas dózisban alkalmazott P. acnes 889 és ATCC 11828 kezelések hatására morfológiai változások és membránkárosodás figyelhetőek meg, melyek a HPV-KER sejtek fokozott pusztulását eredményezik. A fentebb említett megfigyelések mellet további összefüggést találtunk a sejtek morfológiai változásai, valamint a HPV-KER sejtek tenyésztő folyadékának elsavasodása között. Annak eldöntésére, hogy a megfigyelt hatások hátterében milyen tényezők szerepelhetnek, a HPV-KER sejteket eltérő mennyiségű propionsavval (PA) kezeltük. A PA kezelt sejtek mikroszkópos vizsgálata során hasonló morfológiai változásokat figyeltünk meg, mint korábban a P.acnes kezelt sejtek esetében. Ezen eredmények alapján feltételeztük, hogy a PA tehető felelőssé a megfigyelt membránkárosító hatásért. Hogy bizonyítsuk ezen feltevésünket, frissen szeparált humán eritrocitákat kezeltünk P. acnes 6609-es törzzsel PA hiányában illetve jelenlétében, és mértük a felülúszóban található szabad hemoglobin (HgB) mennyiségét. PA kezelés hatására dózisfüggően emelkedett a szabad HgB mennyisége, mely intenzívebb volt P. acnes 6609 kezelés mellett. Ezen törzs esetében nem volt megfigyelhető hasonló hatás a korábbi vizsgálataink során. Mindezen eredményeink arra utalnak, hogy dózis-, és törzs-specifikus különbségek figyelhetők meg egyes P. acnes klinikai izolátumok keratinociták sejtbiológiai folyamataira gyakorolt hatásában. A megfigyelt hatás hátterében a P. acnes törzsek eltérő metabolitikus aktivitása állhat, és a baktérium által termelt PA aktív szerepet tölthet be a P. acnes baktérium által kifejtett citotoxicitásban

Propionibacterium acnes induces autophagy in keratinocytes: involvement of multiple mechanisms

Propionibacterium acnes is a dominant member of the cutaneous microbiota. Herein, we evaluate the effects of different P. acnes strains and propionic acid on autophagy in keratinocytes. Our results showed that P. acnes strain 889 altered the architecture of the mitochondrial network, elevated the levels of LC3B-II, Beclin-1 and phospho-AMPKalpha, stimulated autophagic flux, facilitated intracellular redistribution of LC3B, increased average number of autophagosomes per cell, and enhanced development of acidic vesicular organelles in the HPV-KER cell line. Propionic acid increased the level of phospho-AMPKalpha, enhanced lipidation of LC3B, stimulated autophagic flux, as well as facilitated translocation of LC3B into autophagosomes in HPV-KER cells. P. acnes strains 889, 6609 and heat-killed strain 889 also stimulated autophagosome formation in primary keratinocytes to varying degrees. These results indicate that cell wall components and secreted propionic acid metabolite of P. acnes evoke mitochondrial damage successively, thereby trigger AMPK-associated activation of autophagy, which in turn facilitates the removal of dysfunctional mitochondria and promotes survival of keratinocytes. Thus, we suggest that low-level colonization of hair follicles with non-invasive P. acnes strains, by triggering a local increase in autophagic activity, might exert a profound effect on several physiological processes responsible for the maintenance of skin tissue homeostasis

Biztonságos Scrum változatok áttekintése

A hatékony szoftverfejlesztés egyik alapfeltétele a megfelelő módszertan kiválasztása és alkalmazása. Napjaink egyik legelterjedtebb módszertana a Scrum, amit sok ezer projekt során alkalmaztak sikeresen. Számos előnyös tulajdonsága ellenére a Scrum gyenge pontja az, hogy nem kínál teljes értékű megoldást biztonságkritikus szoftverek fejlesztésére, pl. nem tartalmaz explicit módon biztonsági elemzést és tervezést. Cikkünkben két olyan módszertant (S-Scrum és Secure Scrum) is áttekintünk és értékelünk, ami az eredeti eljárást alkalmassá teszi biztonságkritikus szoftverek fejlesztésére újabb lépések és komponensek beépítésével

Propionibacterium acnes affects the cellular properties of cultured human keratinocytes in a strain-specific and dose-dependent manner

Propionibacterium acnes (P. acnes) bacterium is a member of the skin microflora, but may also serve as an opportunistic pathogen contributing to the pathogenesis of different skin diseases. Earlier we have shown that various P. acnes strains (889, 6609, ATCC 11828) belonging to different phylogroups within the species differentially affected the proliferation and viability of cultured immortalized human keratinocytes (HPV-KER). We found that apart from this strain specificity, the extent of the induced cell biological changes greatly depended on the dose of the bacterial treatment; high doses of the pathogenic 889 and ATCC 11828 strains resulted the death of the HPV-KER cells. In order to analyze this effect in more detail, we performed a fluorescent microscopic analysis of the P. acnes treated cultures, and found cells exhibiting altered morphology and extensive membrane blebbing, characteristic of membrane damage. This was also demonstrated by measuring the quantity of free lactate-dehydrogenase enzyme released to the supernatant from the damaged, bacterial-treated HPV-KER cells using an LDH assay. To demonstrate that the P. acnes induced cell damage is not a keratinocyte specific effect, we also treated human erythrocytes and quantified the rate of membrane damage by measuring the amount of free hemoglobin in the supernatant of the treated cells by spectrophotometry. We found, that in response to the high dose treatment of the same pathogenic strains (889 and ATCC 11828) the amount of free hemoglobin increased. The same treatment conditions also caused marked pH changes (acidification) of the culture supernatants. These results suggest that P. acnes modifies the proliferation and viability of cultured HPV-KER cells in a strain-specific and dose-dependent manner, and this effect may be dependent on the production of an acidic factor possibly generated by the bacterium