Multicolor transzgenikus zebradánió vonalak létrehozása környezettoxikológiai és farmakológiai tesztekhez = Establishment of multicolor transgenic zebra fish lines for environmental toxicology and pharmacology tests

A pályázat támogatásával célunk olyan többszörösen transzgenikus zebradánió vonalak létrehozása volt, amelyek a fő toxikológiai célszervekben (máj, érszövet, vér, idegrendszer) fluoreszcens fehérjéket termelnek, így lehetővé teszik a mérgező anyagok hatásának gyors, in vivo detektálását és nyomon követését a jelölt szervekben. A munka során létrehoztunk egy új génkonstrukciót, amely a májban ösztrogénnel indukálható fluoreszcens fehérje kifejeződését eredményezi. A konstrukciót vad típusú és transzgenikus zebradánió embriókba injektáltuk és néhány alapító egyedből kiindulva létrehoztuk a transzgenikus vonalak F1 majd F2 generációját. A gén konstrukció integrációs helyének és kópiaszámának meghatározását megkezdtük, de költségtakarékossági okokból, csak az ösztrogén indukció alapján a legmegfelelőbb kiválasztott vonalakon végezzük el. A vérben, erekben és az idegrendszerben fluoreszcens fehérjéket kifejező transzgenikus vonalakból kétszeresen transzgenikus, homozigóta F2 vonalakat, valamint többszörösen transzgenikus hemizigóta egyedeket hoztunk létre. Megállapítottuk, hogy a kék színű fluoreszcens fehérje (EBFP) nem alkalmas az indukálható, májspecifikus konstrukció létrehozásához az általunk felállított vizsgálati rendszerben, ezért egy új fluoreszcens fehérje bevonásával (CFP) megkezdtük egy újabb májspecifikus konstrukció kialakítását. | In the framework of the project our aim was to develop multiple transgenic lines expressing fluorescent proteins in the toxicologically important target organs (liver, blood vessels, blood cells, nervous system). These newly developed lines would enable the fast in vivo detection of toxic effects on the labelled organs and the registration of changes. During the project we developed a new transgene construct that drives inducible fluorescent protein expression in the liver. This construct was injected to 1-2 cell wild-type and transgenic zebrafish embryos and the F1 and F2 generation of 3 founders was established. The determination of the transgene integration site and copy number is in progress, however, in order to save cost, it will be performed only on individuals showing the highest fluorescent signal inducibility as a response to estrogenic treatment. In the framework of this project, double transgenic, homozygous F2 individuals and hemizygous, multiple transgenic fish were produced from the available single transgenic lines in which the blood cells, the blood vessels or the nervous tissues are fluorescently labelled. We found out, that the EBFP is not a suitable reporter for developing such transgenic lines, as the signal it produces is too weak to be detectable. So a new blue fluorescent protein (CFP) was selected for building a new, blue construct. Purchasing the encoding plasmid caused a delay

Answers of a Rumanian village to the economic and social challenges

Economic and social changes that took place in Eastern Europe in the 1990's, created a particularly difficult situation for the rural population, especially for those who pursue agricultural production. Those developmental differences that previously characterized the regions, settlements are not moderated significantly after the EU accession of Romania either. However, after the accession numerous positive changes have happened, that help the livability of rural areas. The developed land structure, the production structure of agriculture does not serve the economy effectively, it cannot or it can produce real commodities at a limited extent. An economic survey had been conducted at Mezîomadaras in 2002 and with the partial repetition of the development proposal based on the survey in the summer of 2012 the research looking for answers to the questions, to what extent and in which direction the changed the economy of the village examined, what elements of the development concept achieved. The article shows that how the development, creation of the settlement's infrastructure background (road network), the agricultural, sales information, contribute to some farmers' development to commodity producer, and point out that the cooperation is not typical, the tender activity is very low, despite that the rate of livestock farmers is high

Gabonafélék petesejtjeinek és zigótáinak krioprezerválása = Cryopreservation of gametes in cereals

A pályázat célja a növényi petesejtek ill. zigóták krioprezelválási módszerének kidolgozása gabonaféléken. Meghatároztuk azokat a módszertani feltételeket (adaptációs közeg összetétele, ideje, krioprotektáns anyagok minősége, a fagyasztás módja és a rehidratáció körülményei), melyek segítségével 2 módszert is sikeresen alkalmaztunk növényi petesejtek és zigóták mélyhűtésére. Megállapítottuk, hogy a krioprezervációs módszer sikeressége nagymértékben függ a búza fajtájától. A hidegérézékeny Siete cerros petesejtek csak lassú hűtési eljárással, a hidegtűrő Mironovszkaja az un. vitrifikációs módszerrel is fagyaszthatók. A petesejtekre kidolgozott krioprezervációs módszert sikeresen alkalmaztuk zigóták mélyhűtésére is. Zigóták esetében 10-15%-al nagyobb hatékonyság érhető el. Kimutattuk továbbá, hogy - az aszkorbinsav kedvezően befolyásolja a petesejtek ill. zigóták túlélési képességét úgy a dehidratációs, mind a rehidratációs fázisban. - a krioprotektáns anyagok közül a DMSO, ellentétben számos szomatikus növényi szövettel és sejttel, toxikus hatású a petesejtekre. Helyette a PG sikeresen alkalmzaható. - az előkezelések alacsony hőmérsékleten (T=0°C) végzése mérsékli a krioprotektáns anyagok kedvezőtlen hatását. Strukturális vizsgálatokkal kimutattuk, hogy a krioprezerválás során a petesejtek ill. zigóták belső citoplazmaszerkezete jelentős mértékben árendeződik: az organellumok a plazma sejtmag körüli részén koncentrálódtak, míg a perifériális részen megjelent egy világosabban festődő, organellumokat alig tartalmazó citoplazmarégió. | The aim of the project was to elaborate cryopreservation methods for plant egg-cells and zygotes. The methodological conditions (composition of the adaptation medium, duration of dehydration, quality of cryoprotectants, freezing method, rehydration conditions) were elaborated for deep freezing of plant egg-cells and zygotes. The type of cryopreservation method required and the success with which it could be applied were found to depend greatly on the variety of wheat used in the experiments. While the egg-cells of the cold-sensitive variety Siete Cerros could only be frozen at a slow rate, the vitrification technique was more efficient for the cold-tolerant variety Mironovskaya 808. The cryopreservation method elaborated for egg-cells was also successfully applied to zygotes, where the success rate was 10-15% higher. Moreover, it was demonstrated that -ascorbic acid has a favourable influence on the survival rate of egg-cells and zygotes in both the dehydration and rehydration stages, -among the cryoprotectants tested, DMSO, which can be successfully applied to somatic plant tissues and cells, was found to be toxic to egg-cells, and had to be replaced by PG, -carrying out treatment at low temperature (0°C) reduced the negative effects of the cryoprotectants. Structural analyses revealed a rearrangement of the internal cytoplasm structure in egg-cells and zygotes during cryopreservation: the cell organelles became concentrated in the plasma region around the nucleus, while a more lightly stained cytoplasm region containing hardly any organelles appeared in the peripheral regions

Egy víztisztítási melléktermék, a 3-amino-9-etilkarbazol által kiváltott defektusok felderítése toxikológiai módszerekkel a Zebradanió (Danio rerio) korai életszakaszában = Investigation of effects caused by water disinfection byproduct (3-Amino-9 ethylcarbazole) on zebrafish using toxicological tests and gene expression analysis

Vizsgálataink fő célja egy víztisztítási melléktermék, a 3-amino-9-etilkarbazol (3A9EC) akut és szub-krónikus toxikus hatásainak felderítése volt zebradánió modellszervezeten. Az elsődlegesen alkalmazott teszt egy módosított OECD 236-os embriótoxikológiai vizsgálat volt, amivel az anyag általános toxikus hatásait lehet tanulmányozni. Az eredmények alapján elkészítettünk egy négy napos expozíció utáni LC (letális koncentráció) görbét, valamint meghatároztuk a hozzá tartozó LC50 illetve LC10 értékeket. A teszt során a mortalitás mellett a különböző szubletális tüneteket is megfigyeltük. A kapott akut eredmény alapján a kísérletek második szakaszában a vizsgált anyag szubkrónikus hatásait vizsgáltuk egy 33 napig tartó vizsgálat során. A két alkalmazott koncentrációt az OECD 236-os tesztje alapján kapott 72 órás LC10 érték alatt határoztuk meg. A teszt végére csak az alacsonyabb koncentráció esetén maradtak életben egyedek, melyek mindegyikén megfigyelhetők voltak méretbeli különbségek és jellemző volt a pigmenthiány a kontroll csoporthoz viszonyítva. A vizsgálatokat három traszgenikus zebradánió vonalon folytattuk. A teszt során megfigyelhető volt a 3A9EC ér- és idegrendszer, valamint vese károsító hatása a lárvák 72 órás állapotában. Az eredmények toxikológiai szempontból komplex információt szolgáltatnak a 3A9EC víztisztítási melléktermékekkel kapcsolatban, valamint megállapítható, hogy szükséges az anyag további toxikológiai vizsgálata, mert hosszan tartó fogyasztása káros lehet az élő szervezetekre, így az emberre is. The aim of this study was the investigation of toxic effects of 3-Amino-9 ethylcarbazole (3A9EC) water disinfection byproduct. Tests were carried out according to the modified OECD (Organisation for Economic Cooperation and Development) guideline (No. 236) in order to detect the acute and sub-chronic toxic effects of 3A9EC. At the end of exposure, LC50 and LC10 values for embryo mortality were determined. Next, a subchronic assay of 33 days was conducted to study the lethal and sub-lethal effects of 3A9EC on the early life stage of zebrafish. On the basis of acute test results, embryos were exposed to two test concentrations below the 72h LC10. At the end of the test, only those individuals survived which were treated with the lower concentrations of 3A9EC. Treated embryos showed developmental malfunctions, differences in size and depigmentation compared to the control group. To observe vascular and nervous system effects, experiments were conducted on three transgenic zebrafish lines. Impairments were only detected in 72 hours post fertilization (hpf) larvae. However results provide complex information on the toxic effects of 3A9EC, it seems that the substance could be potentially harmful to living organisms including humans, so further experiments are needed

A versatile modular vector set for optimizing protein expression among bacterial, yeast, insect and mammalian hosts

We have developed a unified, versatile vector set for expression of recombinant proteins, fit for use in any bacterial, yeast, insect or mammalian cell host. The advantage of this system is its versatility at the vector level, achieved by the introduction of a novel expression cassette. This cassette contains a unified multi-cloning site, affinity tags, protease cleavable linkers, an optional secretion signal, and common restriction endonuclease sites at key positions. This way, genes of interest and all elements of the cassette can be switched freely among the vectors, using restriction digestion and ligation without the need of polymerase chain reaction (PCR). This vector set allows rapid protein expression screening of various hosts and affinity tags. The reason behind this approach was that it is difficult to predict which expression host and which affinity tag will lead to functional expression. The new system is based on four optimized and frequently used expression systems (Escherichia coli pET, the yeast Pichia pastoris, pVL and pIEx for Spodoptera frugiperda insect cells and pLEXm based mammalian systems), which were modified as described above. The resulting vector set was named pONE series. We have successfully applied the pONE vector set for expression of the following human proteins: the tumour suppressor RASSF1A and the protein kinases Aurora A and LIMK1. Finally, we used it to express the large multidomain protein, Rho-associated protein kinase 2 (ROCK2, 164 kDa) and demonstrated that the yeast Pichia pastoris reproducibly expresses the large ROCK2 kinase with identical activity to the insect cell produced counterpart. To our knowledge this is among the largest proteins ever expressed in yeast. This demonstrates that the cost-effective yeast system can match and replace the industry-standard insect cell expression system even for large and complex mammalian proteins. These experiments demonstrate the applicability of our pONE vector set