Direct fluorescent labelling of clones by DOP PCR

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Array Comparative Genomic Hybridisation (array CGH) is a powerful technique for the analysis of constitutional chromosomal anomalies. Chromosomal duplications or deletions detected by array CGH need subsequently to be validated by other methods. One method of validation is Fluorescence <it>in situ </it>Hybridisation (FISH). Traditionally, fluorophores or hapten labelling is performed by nick translation or random prime labelling of purified Bacterial Artificial Chromosome (BAC) products. However, since the array targets have been generated from Degenerate Oligonucleotide Primed (DOP) amplified BAC clones, we aimed to use these DOP amplified BAC clones as the basis of an automated FISH labelling protocol. Unfortunately, labelling of DOP amplified BAC clones by traditional labelling methods resulted in high levels of background.</p> <p>Results</p> <p>We designed an improved labelling method, by means of degenerate oligonucleotides that resulted in optimal FISH probes with low background.</p> <p>Conclusion</p> <p>We generated an improved labelling method for FISH which enables the rapid generation of FISH probes without the need for isolating BAC DNA. We labelled about 900 clones with this method with a success rate of 97%.</p

Implementation of array painting for the identification of candidate genes for (non-)syndromic intellectual disability

Verstandelijke beperking, vaak geassocieerd aan bijkomende metabole, structurele of neurologische afwijkingen is niet zeldzaam met een prevalentie van 2-3% in de westerse wereld. Tot op heden werden er ongeveer 300 genen geïdentificeerd die betrokken zijn met verstandelijke beperking. Men verwacht echter dat meer dan duizend genen betrokken zijn bij de vorming en werking van het meest complexe orgaan bij de mens, de hersenen. Het doel van dit project is de identificatie van nieuwe genen betrokken bij cognitie en aangeboren afwijkingen. Als strategie hebben we gebruik gemaakt van positionele klonering aangezien er al aanwijzingen zijn over de locatie van de potentiële kandidaat genen. Koppelingsanalyse in een familie met een syndromale vorm van X-gebonden verstandelijke beperking geassocieerd met kleine gestalte, microcefalie en onderontwikkelde geslachtsorganen resulteerde in een kandidaatinterval van 6 cM op Xp22.1-p21.3. Systematische sequentie analyse van alle genen in dit interval zijn leidde tot de identificatie van een missense mutatie in het POLA1 gen. Deze sequentie variant segregeert met het fenotype in de familie, is geen gekende variant en was niet aanwezig in 620 controle chromosomen. De mutatie leidt tot een verandering van een aminozuur dat sterk geconserveerd is doorheen de evolutie. Om de causaliteit van deze bevinding verder aan te tonen, hebben we mutatie-analyse uitgevoerd in patiënten met een gelijkaardig fenotype of waar koppelingsanalyse hetzelfde interval aanduidde. We hebben geen mutaties gedetecteerd, wat erop kan wijzen dat mutaties in dit gen zeldzaam zijn. Expressie analyse van dit gen in de muis toonde expressie in de regio waar neurale voorloper cellen zich bevinden, naar analogie met andere gekende genen betrokken bij microcefalie. Deze bevinding steunt het idee dat POLA1 mogelijks noodzakelijk is voor het generen van voldoende aantallen neuronale voorloper cellen. In het tweede deel hebben we de breekpunten gekarakteriseerd in patiënten met verstandelijke beperking al dan niet gerelateerd aan bijkomende afwijkingen, en drager van een unieke chromosomale herschikking. Eerst hebben we aangetoond dat chromosomale herschikkingen niet altijd gebalanceerd zijn en dat er cryptische variaties in het kopijaantal kunnen aanwezig zijn die mogelijks de oorzaak zijn van, of bijdragen tot het fenotype. Hieruit besluiten we dat het genoom van de patiënten die drager zijn van een schijnbaar gebalanceerde chromosomale afwijking, eerst geanalyseerd moet worden met aCGH.Het exact lokaliseren van de breekpunten is een tijdrovende procedure door enerzijds de beperkte resolutie en anderzijds de arbeidsintensiviteit van bestaande technieken zoals FISH. In dit project ontwikkelden we daarom een nieuwe techniek, namelijk array painting met gebruik van gedissecteerde chromosomen om sneller de breekpunten te karakteriseren en dit met een hogere resolutie. De toepasbaarheid van deze techniek werd gedemonstreerd in tien patiënten met een chromosoom herschikking. Aangezien we wensten om nieuwe kandidaat genen te identificeren, analyseerden we 28 breekpunten in 13 patiënten met een de novo reciproke translocatie. We observeerden dat in de helft van de breekpunten, een gen rechtsreeks gebroken werd door het breekpunt. Bij een vierde van de breekpunten waren geen genen gelokaliseerd in de nabije regio van het breekpunt. In de overige 10% dienen de BP nog verder met hogere resolutie gekarakteriseerd te worden. Via het raadplegen van literatuur en genoomdatabanken analyseerden we de potentiële kandidaat genen. Na deze analyse, werden de meest beloftevolle kandidaat genen geselecteerd voor verdere validatie via moleculaire analyses en/of expressie analyse in hersenen van de muis. Via deze studie identificeerden we een aantal positionele en biologische kandidaat genen voor verstandelijke handicap en/of aangeboren afwijkingen: ErbB4, QKI, MAGI3, PPP2R2C, ARID1B en MRPP3.status: publishe

Mutation in POLA1 in a family with X-linked syndromic mental retardation

status: publishe

Adaptive distributed caching on an active network

C

Haploinsufficiency of the gene Quaking (QKI) is associated with the 6q terminal deletion syndrome

Subtelomeric rearrangements involving chromosome 6q have been reported in a limited number of studies. Although the sizes are very variable, ranging from cytogenetically visible deletions to small submicroscopic deletions, a common recognizable phenotype associated with a 6q deletion could be distilled. The main characteristics are intellectual disabilities, hypotonia, seizures, brain anomalies, and specific dysmorphic features including short neck, broad nose with bulbous tip, large and low-set ears and downturned corners of the mouth. In this article we report on a female patient, carrying a reciprocal balanced translocation t(5;6)(q23.1;q26), presenting with a clinical phenotype highly similar to the common 6q- phenotype. Breakpoint analysis using array painting revealed that the Quaking (QKI) gene that maps in 6q26 is disrupted, suggesting that haploinsufficiency of this gene plays a role in the 6q- clinical phenotype. (c) 2010 Wiley-Liss, Inc.status: publishe

PPP2R2C, a gene disrupted in autosomal dominant intellectual disability

Intellectual disability (ID) comprises a vast collection of clinically diverse and genetically heterogeneous disorders characterized primarily by central nervous system defects of varying severity with or without additional dysmorphic, metabolic, neuromuscular or psychiatric features. Much progress has been made to elucidate the genetic causes for ID, especially on the X-chromosome. In order to identify autosomal genes involved in ID, patients with a balanced chromosomal rearrangement are a valuable source since the breakpoints may disrupt or deregulate a candidate ID gene(s). Here, we report a familial reciprocal translocation (4;6)(p16.1;q22) that segregates with mild ID, epilepsy and behavioural problems and disrupting the PPP2R2C gene on chromosome 4p. The PPP2R2C gene, encoding a subunit of protein phosphatase 2A, has a unique expression pattern in mouse brain that suggests a role in synaptic plasticity and hence learning and memory.status: publishe

PPP2R2C, a gene disrupted in autosomal dominant intellectual disability

Intellectual disability (ID) comprises a vast collection of clinically diverse and genetically heterogeneous disorders characterized primarily by central nervous system defects of varying severity with or without additional dysmorphic, metabolic, neuromuscular or psychiatric features. Much progress has been made to elucidate the genetic causes for ID, especially on the X-chromosome. In order to identify autosomal genes involved in ID, patients with a balanced chromosomal rearrangement are a valuable source since the breakpoints may disrupt or deregulate a candidate ID gene(s). Here, we report a familial reciprocal translocation (4;6)(p16.1;q22) that segregates with mild ID, epilepsy and behavioural problems and disrupting the PPP2R2C gene on chromosome 4p. The PPP2R2C gene, encoding a subunit of protein phosphatase 2A, has a unique expression pattern in mouse brain that suggests a role in synaptic plasticity and hence learning and memory.status: publishe

Molecular cytogenetic characterisation of a mosaic add(12)(p13.3) with an inv dup(3)(q26.31 --> qter) detected in an autistic boy

ABSTRACT: BACKGROUND: Inverted duplications (inv dup) of a terminal chromosome region are a particular subset of rearrangements that often results in partial tetrasomy or partial trisomy when accompanied by a deleted chromosome. Associated mosaicism could be the consequence of a post-zygotic event or could result from the correction of a trisomic conception. Tetrasomies of distal segments of the chromosome 3q are rare genetic events and their phenotypic manifestations are diverse. To our knowledge, there are only 12 cases reported with partial 3q tetrasomy. Generally, individuals with this genomic imbalance present mild to severe developmental delay, facial dysmorphisms and skin pigmentary disorders. RESULTS: We present the results of the molecular cytogenetic characterization of an unbalanced mosaic karyotype consisting of mos 46,XY,add(12)(p13.3) [56]/46,XY [44] in a previously described 11 years old autistic boy, re-evaluated at adult age. The employment of fluorescence in situ hybridization (FISH) and multicolor banding (MCB) techniques identified the extra material on 12p to be derived from chromosome 3, defining the additional material on 12p as an inv dup(3)(qter --> q26.3::q26.3 --> qter). Subsequently, array-based comparative genomic hybridization (aCGH) confirmed the breakpoint at 3q26.31, defining the extra material with a length of 24.92 Mb to be between 174.37 and 199.29 Mb. CONCLUSION: This is the thirteenth reported case of inversion-duplication 3q, being the first one described as an inv dup translocated onto a non-homologous chromosome. The mosaic terminal inv dup(3q) observed could be the result of two proposed alternative mechanisms. The most striking feature of this case is the autistic behavior of the proband, a characteristic not shared by any other patient with tetrasomy for 3q26.31 --> 3qter. The present work further illustrates the advantages of the use of an integrative cytogenetic strategy, composed both by conventional and molecular techniques, on providing powerful information for an accurate diagnosis. This report also highlights a chromosome region potentially involved in autistic disorders.status: publishe