Pilot scale production (10 L) and characterization of an enzyme concentrate of rPOXA 1B for the removal of dyes

Introducción. Las lacasas (E.C. 1.10.3.2) son enzimas oxidoreductasas multicobre de gran importancia e interés biotecnológico, debido a su alto potencial oxidativo y a que durante la catálisis generan H₂O en lugar de H2O2. Las lacasas son útiles para remover (a través de la decoloración) colorantes sintéticos, oxidar compuestos fenólicos y degradar pesticidas, entre otros. No obstante, para asumir la producción, comercialización y uso a gran escala de las lacasas, es importante conocer la estabilidad y la vida media de la enzima (t1/2); lo que permitiría proponer condiciones de uso y almacenamiento, ajustadas a las características y origen de cada enzima. Objetivos. Producir a escala de 10 L, la enzima recombinante rPOXA 1B de Pleurotus ostreatus expresada en Pichia pastoris para la remoción de color en agua residual coloreada de laboratorio (CLWW) y conocer la estabilidad a tiempo real y acelerada de la misma. Metodología. Se utilizó la cepa recombinante Pichia pastoris X33/pGAPZaA-LaccPost-Stop (Clon 1) para la expresión de la lacasa POXA 1B (rPOXA 1B) de Pleurotus ostreatus. Se estandarizó la técnica para la detección de la actividad enzimática a través de dos diseños experimentales, un “D-optimal Design” y un “D-optimal Design (irregular)” para identificar las mejores condiciones de deteción en tampón acetato y tampón citrato respectivamente. El complejo enzima-sustrato fue evaluada mediante análisis de acoplamiento molecular empleando Autodock Vina. Luego se llevó a cabo la producción de 3 lotes de rPOXA 1B (L1, L3 y L4) en biorreactor a escala de 10 L con volumen efectivo de trabajo (VET) de 6 L, empleando un medio de cultivo previamente mejorado en nuestro grupo de investigación. Se optimizó (a escala de laboratorio) un medio de cultivo de bajo costo a través de la implementación de tres diseños experimentales; dos “Central Composite Design” (CCD-1 y CCD-2), seguidos de un “One Factor Experimental Design” (OFED). Se demostró (a escala de laboratorio) el efecto de la adición de metanol (CH3OH) después del agotamiento de la glucosa (C6 H12O6) para lo cual se utilizaron cuatro medios de cultivo diferentes con y sin adición de CH3OH. Para los estudios de estabilidad a tiempo real (RTS) con duración de 1 año, se utilizó parte de los concentrados enzimáticos (impuros y sin preservantes) provenientes de los lotes L1, L3 y L4, para lo cual se implementaron cinco temperaturas teóricas, -30, 4, 25, 30, 35 y 40 °C, [243.15, 277.15, 298.15, 303.15, 308.15 y 313.15 K] y utilizando la ecuación de Arrhenius se evaluó la estabilidad acelerada (AS) del concentrado de rPOXA 1B. El RTS fue soportado computacionalmente con estudios de dinámica molecular (MD) a cuatro temperaturas diferentes (-32, 5, 25 y 41°C); [241, 278, 298 y 314 K] muy cercanas a las evaluadas experimentalmente. Otra parte de los concentrados enzimáticos de los lotes L1, L3 y L4 se utilizaron en la remoción de colorantes en aguas residuales coloreadas de laboratorios (CLWW) de prácticas e investigación de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C., Colombia. Se realizaron tres procesos (P1, P2 y P3) de remoción, empleando CLWW a 1500 unidades de color (UC), en una Planta Piloto de Tratamiento que consta de un tanque de homogeneización, neutralización y mezcla de 20 L, seguido de un biorreactor de aireación prolongada (flujo turbulento y oxígeno de disolución > 1 mgL-1) de 15 L con 10 L de VET, a temperatura ambiente del laboratorio (~19 ± 3 °C) y con un tiempo de retención hidráulica de 72 h, seguido de dos filtros de arena cuarcítica. Durante el curso de la investigación y de acuerdo a la exigencia de cada metodología, se midió: actividad enzimática (UL-1), concentración de proteínas (mg mL-1), concentración de azúcares reductores (gL-1), actividad específica (Umg-1), biomasa (gL-), velocidad específica de crecimiento µx (h-1), tiempo de duplicación td (h), velocidad máxima de reacción Vmax (mM min-1), constante de Michaelis-Menten KM (mM), productividad (UL-1h-1), carbono total (CT) (mgL-1), nitrógeno total (NT) (mgL-1), relación carbono-nitrógeno C/N, constante de desactivación kd (meses-1), vida media t1/2 (meses), energía de desactivación Ed (kJ mol-1), variación de entalpía H* (kJ mol-1), variación en la energía libre de Gibb´s G* (kJ mol-1), variación de entropía S* (J mol-1K-1), carbono inorgánico (CI) (mgL-1), carbono orgánico total (COT) (mgL-1), demanda química de oxígeno (DQO) (mgL-1), demanda biológica de oxígeno a los 5 días DBO5 (mg L-1), relación COT/NT, relación DQO/COT, pH, unidades de color UC e índice de germinación IG (%). Resultados. El uso de tampón citrato incrementó la afinidad de rPOXA 1B por el sutrato (ABTS) con una KM inferior a la del tampón acetato; las condiciones estandarizadas fueron pH 3.0 ± 0.2; λ420 nm, 2 mM ABTS y los análisis de acoplamiento molecular obtuvo un complejo de unión enzima sustrato con una energía libre de unión de -6.4 KJ mol-1. En biorreactor de 10 L con el medio previamente mejorado se obtuvo 8,506.95 ± 1,993.65 UL-1 con actividad específica de 213.64 ± 55.83 Umg-1 a las 192 h de cultivo, usando tampón citrato. Después de la optimización estadística secuencial se obtuvo un medio (20 gL-1 glucosa USP, 50 g L-1 proteína de soya aislada 90 % (p/p), 11.74 g L-1 extracto de malta, 4.91 gL-1 (NH4)2SO4, 0.16 gL-1 CuSO4 y 0.1 gL-1 cloranfenicol) 89.84 % menos costoso, con una actividad enzimática de 12,877.3 ± 481.2 UL-1 y actividad específica de 1324.58 ± 114.19 U mg-1 en 168 h, lo que significó un incremento en la actividad enzimática del 33.94 % con relación a los resultados en biorreactor de 10 L con medio mejorado. La adición de metanol después del agotamiento de la glucosa tuvo un efecto positivo sobre la actividad enzimática y se obtuvo 14,868.06 ± 461.58 U L-1 con actividad específica de 1597.6 ± 76.28 U mg-1 en 192 h utilizando el medio optimizado de bajo costo, para un incremento de 41 % de la actividad enzimática en comparación con el mismo medio sin adición de metanol. En el RTS se recuperó 101.16, 115.81, 75.23, 46.09, 5.81 y 4.83 % de la actividad enzimática relativa, a las diferentes temperaturas ensayadas. Los estudios de AS mostraron que el concentrado de rPOXA 1B se puede conservar a 240.98 5.38, 277.40 1.32 o 297.53 3.88 K con t1/2 de 230.8, 46.2 y 12.6 meses, respectivamente. Los parámetros cinéticos y termodinámicos respaldaron la alta estabilidad de rPOXA 1B con bajas variaciones de KM y Vmax a temperaturas de 240.98 5.38 y 297.53 3.88 K, Ed de 41.40 KJ mol-1 y valores apropiados de ∆H, ∆G y ∆S. La MD mostró que las fluctuaciones en la estructura 3D de POXA 1B, específicamente en regiones bucle, coils or loops con aminoácidos hidrofílicos o de polaridad intermedia, así como en algunos residuos, se incrementa con el aumento de la temperatura; pasando de 3 residuos fluctuantes (LEU159, ALA391 y ASP429) a 278 K a 6 residuos (THR160, ASP266, GLU293, ALA334, ASP341 y LEU459) a 298 K y a 9 residuos (ASP101, THR160, GLY265, ASN297, ALA334, GLY370, ALA391, PRO393 y ASP433) a 314 K. La remoción de color promedio del CLWW (1500 UC) fue de 96.75 % y se logró la reducción de los parámetros de descarga TOC, TC, DQO y DBO5. Conclusiones. Con el medio optimizado se aumentó la actividad enzimática 33 % con relación al medio previamente mejorado. Se demostró el efecto positivo de añadir CH3OH al cultivo, después del agotamiento de la glucosa, lo que generó un incremento de 41 % en comparación con el medio sin metanol. Es importante destacar que la adición de metanol no es una opción amigable con el medio ambiente, ya que el concentrado enzimático se utiliza impuro y podría contener trazas de metanol, pero resulta de utilidad si se requiere la producción de la enzima pura para usos no ambientales, además, de que rompe con el hábito de utilizar estrictamente glucosa para la expresión de proteínas recombinantes bajo el control del promotor pGAP, como sucede con la mayoría de los trabajos publicados. La lacasa rPOXA 1B es una enzima estable, lo cual fue demostrado experimental y computacionalmente con t1/2 de 230.8, 46.2 ó 12.6 meses, si es conservada impura y sin preservantes a temperaturas de 240.98 5.38, 277.40 1.32 o 297.53 3.88 K respectivamente, lo cual tiene gran utilidad para los grandes productores. El tratamiento secundario de CLWW (1500 UC) con el concentrado de rPOXA 1B generó una remoción de color promedio de 96 % en 72 h de tratamiento con disminución de los parámetros de vertimiento.Introduction. Laccases (EC 1.10.3.2) are multi-copper oxidoreductase enzymes of great importance, and biotechnological interest, due to their high oxidative potential, and the fact that during catalysis they generate H2O instead of H2O2. Laccases are useful for removing (by bleaching) synthetic dyes, oxidizing phenolic compounds, and degrading pesticides, among others. However, to assume the large-scale production, commercialization, and use of laccases, it is important to know the stability, and half-life (t1/2) of the enzyme, which would allow proposing conditions of use, and storage, adjusted to the characteristics, and origin of each enzyme. Objective. To produce at 10 L scale, the recombinant enzyme rPOXA 1B from Pleurotus ostreatus expressed in Pichia pastoris for the removal of color in colored laboratory wastewater (CLWW), and to know its real-time, and accelerated stability. Methodology. The recombinant strain Pichia pastoris X33/pGAPZaA-LaccPost-Stop (Clone 1) was used for the expression of the laccase POXA 1B (rPOXA 1B) from Pleurotus ostreatus. The technique for the detection of enzymatic activity was standardized through two experimental designs, a "D-optimal Design", and a "D-optimal Design (irregular)" to identify the best detection conditions in acetate buffer, and citrate buffer, respectively. The enzyme-substrate complex was evaluated by molecular docking analysis using Autodock Vina. Then, the production of 3 batches of rPOXA 1B (L1, L3, and L4) was carried out in a bioreactor at 10 L scale, with an effective working volume (EWV) of 6L, using a previously improved culture medium in our group of investigation. A low-cost culture medium was optimized (on a laboratory scale) through the implementation of three experimental designs; two “Central Composite Design” (CCD-1, and CCD-2), followed by a “One Factor Experimental Design” (OFED). The effect of the addition of methanol (CH3OH) after depletion of glucose (C6H12O6) was demonstrated (at a laboratory scale) for which four different culture media with, and without addition of CH3OH were used. For the real-time stability studies (RTS) for 1 year, part of the enzyme concentrates (impure and without preservatives) from batch L1, L3, and L4 were used, for which five theoretical temperatures were implemented, - 30, 4, 25, 30, 35, and 40 ° C, [243.15, 277.15, 298.15, 303.15, 308.15, and 313.15 K], and using the Arrhenius equation, the accelerated stability (AS) of the rPOXA 1B concentrate was evaluated. The RTS was computationally supported with molecular dynamics (MD) studies at four different temperatures (-32, 5, 25, and 41ºC); [241, 278, 298, and 314 K] very close to those evaluated experimentally. Another part of the enzyme concentrates from bath L1, L3, and L4 were used in the removal of colorants in colored wastewater from laboratories (CLWW) of practices, and research of the Faculty of Sciences of the “Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, DC, Colombia”. Three removal processes (P1, P2, and P3) were carried out, using CLWW at 1500 color units (UC), in a Pilot Treatment Plant consisting of a 20 L homogenization, neutralization, and mixing tank, followed by a bioreactor prolonged aeration (turbulent flow, and dissolution oxygen > 1 mg L-1) of 15 L with 10 L of EWV, at room temperature of the laboratory (~19 ± 3 °C), and with a hydraulic retention time of 72 h, followed of two quartzite sand filters. During the course of the research, and according to the requirement of each methodology, were measured: enzyme activity (UL-1), protein concentration (mg mL-1), reducing sugar concentration (gL-1), specific activity ( Umg-1), biomass (gL-1), specific growth rate µx (h-1), doubling time td (h), maximum reaction rate Vmax (mM min-1), Michaelis-Menten constant KM (mM), productivity (UL-1h-1), total carbon (TC) (mgL-1), total nitrogen (NT), (mgL-1), carbon-nitrogen C/Nratio, deactivation constant kd (months-1) , half-life t1/2 (months), deactivation energy Ed (kJ mol-1), enthalpy variation H* (kJ mol-1), variation in Gibb's free energy G* (kJ mol-1), entropy change S* (J mol-1K-1), inorganic carbon (CI) (mgL-1), total organic carbon (TOC) (mgL-1), chemical oxygen demand (COD) ( mgL-1), biological oxygen demand at 5 days BOD5 (mgL-1), TOC/NTratio, COD/TOCratio, pH, color units UC, and germination index GI (%). Results. The use of citrate buffer increased the affinity of rPOXA 1B for substrate (ABTS) with a lower KM than that obtained in acetate buffer; the standardized conditions were pH 3.0 ± 0.2; λ420 nm, 2 mM ABTS and molecular docking analysis yielded a binding free energy of -6.4 KJ mol-1. In a 10 L bioreactor with the previously improved medium, 8,506.95 ± 1,993.65 UL-1 was obtained with a specific activity of 213.64 ± 55.83 Umg-1 at 192 h of culture, using citrate buffer. After sequential statistical optimization, a medium was obtained (20 gL-1 glucose USP, 50 gL-1 isolated soy protein 90 % (w/w), 11.74 gL-1 malt extract, 4.91 gL-1 (NH4)2SO4, 0.16 gL-1 CuSO4, and 0.1 gL-1 chloramphenicol) 89.84 % less expensive, with an enzymatic activity of 12,877.3 ± 481.2 UL-1, and specific activity of 1324.58 ± 114.19 Umg-1 in 168 h, which meant an increase of 33.94 % of enzyme activity, in relation to the results obtained at 10 L bioreactor with an improved medium. The addition of methanol after depletion of glucose had a positive effect on the enzyme activity, and 14,868.06 ± 461.58 UL-1 was obtained with a specific activity of 1597.6 ± 76.28 Umg-1 in 192 h using the optimized low-cost medium, for a 41% increase in enzyme activity compared to the same medium without the addition of methanol. In the RTS, 101.16, 115.81, 75.23, 46.09, 5.81, and 4.83 % of the relative enzyme activity were recovered, at the different temperatures tested. AS studies showed that rPOXA 1B concentrate can be stored at 240.98 ± 5.38, 277.40 ± 1.32, or 297.53 ± 3.88 K, with t1/2 of 230.8, 46.2, and 12.6 months, respectively. The kinetic, and thermodynamic parameters supported the high stability of rPOXA 1B with low variations of KM, and Vmax at temperatures of 240.98 ± 5.38, and 297.53 ± 3.88 K, Ed of 41.40 KJ mol-1, and appropriate values of ∆H, ∆G, and ∆S. The MD indicated that fluctuations in the 3D structure of POXA 1B, specifically in loop regions, coils or loops with hydrophilic or intermediate polarity amino acids, as well as in some residues, increases with increasing temperature; going from 3 fluctuating residues (LEU159, ALA391, and ASP429) at 278 K to 6 residues (THR160, ASP266, GLU293, ALA334, ASP341, and LEU459) at 298 K, and to 9 residues (ASP101, THR160, GLY265, ASN297, ALA334, GLY370 ALA391, PRO393, and ASP433) at 314 K. The average of color removal of the CLWW (1500 UC) was 96.75 %, and the reduction of the discharge parameters TOC, TC, COD, and BOD5 was achieved. Conclusions. With the optimized medium, the enzyme activity was increased by 33 % about the previously improved medium. The positive effect of adding CH3OH to the culture, after depletion of glucose, was demonstrated, which generated an increase in enzyme activity of 41% compared to the medium without methanol. It is important to note that the addition of methanol is not an environmentally friendly option, since the enzyme concentrate is used impure, and may contain traces of methanol, but it is useful if the production of the pure enzyme is required for non-environmental uses. Furthermore, it breaks the habit of strictly using glucose for the expression of recombinant proteins under the control of the pGAP promoter, as is the case with most of the published works. Laccase rPOXA 1B is a stable enzyme, which was demonstrated experimentally, and computationally with t1/2 of 230.8, 46.2 or 12.6 months, if it is preserved impure, and without preservatives at temperatures of 240.98 ± 5.38, 277.40 ± 1.32 or 297.53 ± 3.88 K respectively, which is very useful for large scale producers. The secondary treatment of CLWW (1500 UC) with the rPOXA 1B concentrate generated an average of color removal of 96 % in 72 h of treatment with a decrease in the discharge parameters.Doctor en Ciencias BiológicasDoctoradohttps://orcid.org/0000-0002-1346-5582https://scienti.minciencias.gov.co/cvlac/visualizador/generarCurriculoCv.do?cod_rh=000090566

Isolation and characterization of rhizobacteria associated with rice crops (Oryza sativa L.) in Norte de Santander (Colombia)

Las rizobacterias promotoras de crecimiento vegetal son reconocidas y estudiadas por sus efectos benéficos en varios cultivos. Cepas de los géneros Azotobacter y Pseudomonas se aislaron de suelo rizosférico de cultivos de arroz (Oryza sativa L.) de 10 fincas en el distrito de riego del río Zulia, Norte de Santander, Colombia. El aislamiento bacteriano se hizo a partir de gránulos de suelo y diluciones seriadas de suelo, sembradas en agar Ashby para Azotobacter y King B para Pseudomonas fluorescentes, respectivamente. Cuarenta y dos aislamientos se conservaron en viales con solución salina estéril (0.85 % NaCl) en refrigeración a 4 °C y se ingresaron al Banco de Cepas del Laboratorio de Investigaciones en Biología Aplicada de la Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta, Colombia. Para seleccionar aislamientos con potencial para el desarrollo de inoculantes microbianos, en todas las cepas se determinó su capacidad de solubilización de fosfato inorgánico, fijación biológica de nitrógeno, síntesis de ácido indoloacético y sideróforos. Con un conglomerado jerárquico de las medianas de las cuatro actividades se seleccionaron cuatro aislamientos por presentar los valores más cercanos a los testigos diseñados como cepas promisorias en las cuatro actividades según el dendrograma de similitudes. Estas cuatro cepas se identificaron como Pseudomonas putida (RzA027 y RzA035), Azotobacter chrococcum (RzA040) y Azotobacter tropicalis (RzA042) mediante amplificación del gen 16S ADNr.The plant-growth promoting rhizobacteria are recognized and studied for their beneficial effects on several crops. Strains of the Azotobacter and Pseudomonas genera were isolated from rhizospheric soil where rice crops (Oryza sativa L.) are grown, from 10 farms located in the Zulia River’s irrigation district, Norte de Santander, Colombia. The bacterial isolation was obtained from granular soil and serial soil dilutions, which were planted on Ashby and King B agar, for Azotobacter and fluorescent Pseudomonas, respectively. Forty-two isolates were stored in vials with a sterile saline solution (0.85 % NaCl) in a refrigerator at 4 °C and were deposited in the Bank of Strains of the Applied Biology Research Laboratory of the Universidad Francisco de Paula Santander, Cúcuta, Colombia. The capacity to solubilize inorganic phosphate, to fix biological nitrogen, and to synthesize indoleacetic acid and siderophores were determined in all strains, in order to select isolates with potential to develop microbial inoculum. With a hierarchical clustering of the medians of the four activities, four isolations were selected because they presented the closest values to the controls designed as promising strains in the four activities, according to the similarity dendrogram. These four strains were identified as Pseudomonas putida (RzA027 and RzA035), Azotobacter chrococcum (RzA040), and Azotobacter tropicalis (RzA042), by amplification of the 16S rDNA gene

Impact of Antibiotics as Waste, Physical, Chemical, and Enzymatical Degradation: Use of Laccases

The first traces of Tetracycline (TE) were detected in human skeletons from Sudan and Egypt, finding that it may be related to the diet of the time, the use of some dyes, and the use of soils loaded with microorganisms, such as Streptomyces spp., among other microorganisms capable of producing antibiotics. However, most people only recognise authors dating between 1904 and 1940, such as Ehrlich, Domagk, and Fleming. Antibiotics are the therapeutic option for countless infections treatment; unfortunately, they are the second most common group of drugs in wastewaters worldwide due to failures in industrial waste treatments (pharmaceutics, hospitals, senior residences) and their irrational use in humans and animals. The main antibiotics problem lies in delivered and non-prescribed human use, use in livestock as growth promoters, and crop cultivation as biocides (regulated activities that have not complied in some places). This practice has led to the toxicity of the environment as antibiotics generate eutrophication, water pollution, nutrient imbalance, and press antibiotic resistance. In addition, the removal of antibiotics is not a required process in global wastewater treatment standards. This review aims to raise awareness of the negative impact of antibiotics as residues and physical, chemical, and biological treatments for their degradation. We discuss the high cost of physical and chemical treatments, the risk of using chemicals that worsen the situation, and the fact that each antibiotic class can be transformed differently with each of these treatments and generate new compounds that could be more toxic than the original ones; also, we discuss the use of enzymes for antibiotic degradation, with emphasis on laccases