Economic and zoonotic importance of co-infection by Eimeria and Toxoplasma in chicken herds

Einleitung: Eimeria (E.) spp. und Toxoplasma (T.) gondii sind intrazelluläre Protozoen aus dem Phylum Apicomplexa und stellen bedeutende Pathogene dar. Infektionen mit Eimeria spp. sind Auslöser der Kokzidiose, welche eine der ökonomisch bedeutsamsten Erkrankungen in der Geflügelproduktion darstellt. Die Toxoplasmose des Huhnes hingegen verläuft in der Regel subklinisch. Da beide Parasiten, Eimeria spp. und Toxoplasma gondii, weltweit verbreitet sind, können natürliche Koinfektionen auftreten. Prävalenzstudien mit Hilfe molekularer und serologischer Untersuchungsmethoden sind geeignet, um die Vorkommen, Verbreitung, und Speziesidentität von einzelnen Apicomplexa zu untersuchen, was zu besserer Diagnose, Kontrolle, und Bestandsüberwachung beiträgt. Trotz vorliegender Hinweise, dass bei Koinfektionen zu einer Interaktion zwischen Eimeria und Toxoplasma kommt, existieren Erkenntnislücken hinsichtlich der Häufigkeit und der Bedeutung von natürlichen Koinfektionen des Huhnes unter Feldbedingungen, insbesondere mit Augenmerk auf verschiedene Nutzungstypen, Produktions- und Haltungsbedingungen. Ziele der Untersuchungen: Die Ziele der Untersuchungen waren die Erhebung der Prävalenzen von verschiedenen Eimeria spp. und von T. gondii bei Hühnern, sowie die Häufigkeit ihres Auftretens als Einzel- und Koinfektionen unter Feldbedingungen unter Berücksichtigung verschiedener Nutzungstypen und Haltungsbedingungen in Griechenland. Tiere, Material und Methoden: Die Auswahl der für diese Feldstudie untersuchten Hühnerbestände erfolgte auf Basis der Anzahl von kommerziellen Hühnerhaltungen in drei Hauptregionen Griechenlands. Nach offiziellen Angaben des griechischen Ministeriums für Ländliche Entwickung und Lebensmittel konzentriert sich die griechische Geflügelindustrie hauptsächlich auf Epirus (im Nordwesten), Zentralmazedonien, und Zentralgriechenland. Die Probenentnahme erfolgte in kommerziellen und Hinterhofhaltungen, wobei die Probenanzahl proportional zur Anzahl entsprechender Haltungsformen in der jeweiligen Region gewählt wurde (n = 50). Es wurden Legehennen (n = 21), langsam wachsende Broiler (n = 15) und Hinterhofhühner beprobt (n = 14), welche verschiedenen Produktions- und Haltungsbedingungen zugeordnet waren (Haltung in ausgestalteten Käfigen, Bodenhaltung mit Einstreu und Biohaltung). Konventionelle intensive Broileraufzuchten wurden nicht berücksichtigt. Für die Erhebung der Häufigkeiten von Eimeria spp.-Infektionen wurden aus allen ausgewählten Beständen Einstreuproben gesammelt (n = 756). Die Broilerherden wurden zu einem Zeitpunkt bei der Schlachtung erneut beprobt, indem die Därme der Einzeltiere gesammelt wurden (n = 162). Die Einstreu-/Darminhaltsproben wurden quantitativ mittels McMaster-Verfahrens auf den Eimeria spp.-Oozystengehalt (als Oozysten pro Gramm Kot, OPG) untersucht. Die Eimeria-Oozysten aus positiven Proben wurden für weitere molekulare Analysen aufgereinigt und aufbewahrt. Die Eimeria-Speziesbestimmung erfolgte durch spezies-spezifische DNA-Nachweise, und die Quantifizierung der einzelnen Arten erfolgte semiquantitativ. Um die Häufigkeit von T. gondii-Infektionen zu bestimmen, wurden Blutproben (n = 1,021) von Einzeltieren zur serologischen Untersuchung mittels TgSAG1 ELISA entnommen, zeitgleich zur o. g. Beprobung der Bestände für die Einstreuproben. Für Hinterhofhaltungen mit Tieren variablen Alters wurden ältere Tiere bevorzugt beprobt, und in kommerziellen Legehennenhaltungen wurden die Tiere im Alter von ca. 10 Monaten beprobt. In beiden Fällen wurden von T. gondii-seropositiven Tieren bei der Schlachtung die Herzen gewonnen (n = 322). In Broilerhaltungen wurden ebenfalls Blutproben und das Herz während des Schlachtungsprozesses zum T. gondii-Nachweis entnommen. Das Herzgewebe wurde in einer magnetic capture Polymerasekettenreaktion (mc-PCR) sowie einem Mausbioassay auf Präsenz und Genotyp einzelner Isolate untersucht. Parallel zu den Laboruntersuchungen wurden Daten zu Haltungsbedingungen, Biosicherheitsmaβnahmen, Lage, Bestandsgröβe, Krankheitsgeschichte etc. mittels standardisierter Fragebögen erfasst, um potenzielle Risikofaktoren für Eimerien- und/oder T. gondii-Infektionen zu bestimmen. Die Datenanalyse erfolgte durch Multilevel-Modelling (generalized linear mixed modelling fit by maximum likelihood (Laplace approximation)) mittels dem R-Programm (https://www.r-project.org, Version 4.0.2, Paket lme4), dem Kruskal-Wallis-Test und bivariaten Spearman-Korrelationen im PSPP-Prgramm (GNU PSPP 1.3.0). Ergebnisse: Insgesamt lag die Nachweisrate für Eimeria spp.-Infektionen bei 85,7 %. Alle sieben Hühnereimerienspezies wurden identifiziert, wobei E. acervulina (79,3 %) und E. tenella (65,5 %) die höchste Prävalenz aufwiesen. Infektionen mit mehreren Eimeria-Arten (79,3 %) waren deutlich häufiger anzutreffen als Einzelinfektionen (20,7 %). Als Risikofaktoren wurden Herdengröβe, Art des Auslaufs und Produktionssystem identifiziert. Zwischen respiratorischen Erkrankungen und mittlerer OPG wurde in Broilerhaltungen eine sehr starke Korrelation beobachtet (P < 0.001). Biohaltungen zeigten eine höhere Prävalenz von E. tenella (P = 0,023). Nutzung einer bewachsenen Auslauffläche war stark mit der Präsenz von E. brunetti korreliert (P < 0,001). Die T. gondii-Seroprävalenz über alle untersuchten Tiere betrug 9,5 %. Dabei testeten 41,2 % aller Hinterhofhühner seropositive. In 70 % der Bio- und Freilaufhaltungen wurde mindestens ein Tier seropositiv getestet. Es wurden keine T. gondii-seropositiven Broiler gefunden, obwohl mit Hilfe der mc-PCR positive DNA-Nachweise erfolgten. Dies belegt die hohe Sensitivität der mc-PCR und ihre potenzielle Eignung für die Detektion früher Infektionen bei Hühnern. Die T. gondii-Isolate, welche im Mausbioassay gewonnen wurden, wurden als Typ II (ToxoDB#3) genotypisiert, was durch Mikrosatellitenanalyse bestätigt wurde. Für T. gondii-Infektionen wurden Produktionssystem und Futterautomatisierung als Risikofaktoren identifiziert, wobei Auslaufbeweidung die Wahrscheinlichkeit für T. gondii-Infektionen erhöht. Die Gegenwart von Katzen stellte hingegen keinen nachweisbaren Risikofaktor für T. gondii-Seropositivität auf Bestands- oder Einzeltierniveau dar. Koinfektionen mit beiden Protozoen wurden in 87% aller untersuchten Hühnerbestände nachgewiesen, wobei Hinterhof-, Bio-, und Freilandhaltungen am häufigsten betroffen waren. In den moisten Fällen von Koinfektionen wurde E. acervulina nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Die Prävalenz sowohl von Eimeria spp. als auch von T. gondii war generell hoch und auf einem vergleichbaren Niveau mit den Ergebnissen früherer Studien in anderen Ländern. Faktoren wie Produktionssystem, Haltungs- und Managementbedingungen sind mit dem Risiko von Mono- oder Koinfektionen verbunden. Die gewonnenen Erkenntisse erlauben die gezielte Planung zukünftiger Studien hinsichtlich sich ändernder Haltungsbedingungen, z. B. dem Trend zur verstärkten Bio- und tierfreundlichen Hühnerhaltung uns dem Einsatz langsam wachsender Rassen. Es besteht auch in Griechenland ein Bedarf an nachhaltiger Kontrolle von Kokzidieninfektionen, einschlieβlich der Minimierung zoonotischer Erreger wie T. gondii in Nutztierbeständen. Die verwendeten serologischen und molekularen Methoden können nach den Studienerkenntnisse ausserdem zur frühzeitigen Überwachung von T. gondii–Infektionen in Hühnerbeständen beitragen.:Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Literature Review 2.1 Eimeria spp. 2.1.1 Life cycle 2.1.2 Diagnosis and control of Coccidiosis in chickens 2.1.3 Economic Impact of Coccidiosis 2.1.4 Prevalence of Eimeria spp. in chicken farms 2.1.5 Data of chicken coccidiosis from Greece 2.2 Toxoplasma gondii 2.2.1 Life cycle 2.2.2 Toxoplasmosis and Zoonotic Importance 2.2.3 Prevalence in poultry and risk factors 2.2.4 T. gondii data from Greece 2.3 Co-existence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii in chickens Chapter 3 - Overview of own scientific work 3.1 Aims 3.2 Presentation of own scientific work: Publications 3.2.1 Publication 1: Prevalence and molecular detection of Eimeria species in different types of poultry in Greece and associated risk factors. 3.2.2 Publication 2: Prevalence and molecular characterization of Toxoplasma gondii in different types of poultry in Greece, associated risk factors and co-existence with Eimeria spp. Chapter 4 - Overreaching Discussion Chapter 5 - Conclusions Chapter 6 - Summary Chapter 7 - Zusammenfassung Chapter 8 - References AcknowledgementsIntroduction: Eimeria spp. and Toxoplasma gondii are intracellular Apicomplexan protozoa and represent important pathogens for chickens. Coccidiosis, caused by Eimeria spp. is one of the most notable diseases in chickens having a high economic impact on the poultry industry worldwide, while toxoplasmosis is usually subclinical in these hosts. As both Eimeria spp and Toxoplasma gondii have a broad worldwide distribution, natural co-infections in chickens can occur. Prevalence studies using molecular and serological techniques have proven a very useful approach to study the diversity and distribution of these parasites’ mono-infections, further contributing to more efficient diagnosis, control and monitoring. Despite existing indications that these two parasites interact when the host is infected simultaneously, there are still knowledge gaps regarding the frequency and impact of naturally occurring co-infections under field conditions, particularly in different types of poultry, production and housing systems. Objective: Determination of the level of occurrence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii mono- and co-infections under field conditions, in different types of chickens and farm profiles in Greece. Animals, materials and methods: Selection of poultry operations was based on the number of commercial farms in three major Greek regions, as poultry farms in Greece are highly concentrated in Epirus (in North-Western Greece), Central Macedonia, and Central Greece, based on the data from the Hellenic Ministry of Rural Development and Food. Sampling from both commercial operations and backyard farms was conducted proportionately to their frequency (n=50) and type of flocks included in the study were layers (n=21), slow-growing broilers (n=15) and backyard chickens (n=14), under different production and housing systems (enriched cages, floor-housed in litter, free-range and organic systems). Conventional intensively reared broilers were not included in the study. To record Eimeria spp. occurrence, faecal samples were collected from the litter of the chicken housing (n=756). Broiler flocks were followed up to the slaughterhouse for a second sampling where the whole gut was collected (n=162). Samples were quantitatively examined by a modified McMaster technique to calculate oocysts per gram (OPG) of faeces, followed by collection and purification of the oocysts for further molecular analysis. Species identification was performed by multiple PCR assays using species-specific primers and PCR bands were categorized by intensity semiquantitavely. To record Toxoplasma gondii infections, simultaneously to faecal sampling, blood samples (n=1,021) were also collected from individual animals for serological T. gondii detection via TgSAG1 ELISA. In our sampled broiler flocks, animals were sampled at slaughter, where blood samples and the heart were collected for T. gondii detection. In backyard flocks, blood samples were taken from the older animals and in layers from individual animals (at the age of approximately 10 months). Toxoplasma positive animals were followed up to slaughter to collect heart tissue (n=322), further processed for bioassay in KO mice and mc-PCR in order to characterize Toxoplasma gondii isolates. In parallel, potential risk factors and impact regarding mono- and co-infection of both parasites were investigated through an obtained questionnaire containing additional information about farm management, biosecurity status, location, production rate and diseases history. For the data analysis a multilevel-modelling (generalized linear mixed modelling fit by maximum likelihood (Laplace approximation)) was performed using R (https://www.r-project.org) version 4.0.2, by applying the package lme4, as well as Kruskal-Wallis tests and bivariate correlations in PSPP statistical program (GNU PSPP 1.3.0). Results: Overall Eimeria spp. positivity level was 85.7%. All seven Eimeria species were identified with E. acervulina (79.3%) and E. tenella (65.5%) being the most prevalent ones. Mixed infections (79.3%) were more common than single-species (20.7%) Significant identified risk factors were flock size, type of outdoor area, and production system. A very strong correlation (p < 0.001) was found between the presence of respiratory disease and the average OPG level in broiler farms. Organic flocks showed higher prevalence of E. tenella (p = 0.023), while presence of vegetation at the outdoor area correlated strongly with E. brunetti (p < 0.001). Toxoplasma gondii seroprevalence was 9.5%. 41.2% of the backyard chickens sampled were seropositive and 70% of the organic and free-range layer farms had at least one Toxoplasma gondii seropositive hen. No serologically positive broilers were found, however mc-PCR revealed positive samples, stressing out the high sensitivity and potential contribution of this method in early detection of the parasite. Toxoplasma gondii isolates obtained by mouse bioassay were genotyped and found to belong to type II (ToxoDB#3) as confirmed also by microsatellite typing. The most significant risk factors were production system and feeding system automation, with free-grazing practices increasing the likelihood for Toxoplasma infections. Presence of cats showed no association with Toxoplasma gondii seropositivity on a farm and individual animal level. The two protozoan parasites were found to co-exist in 87% of the studied poultry operations, with backyard, organic and free-range farms showing the highest occurrence. E. acervulina was the species identified in most of the co-existence cases. Conclusions: Prevalence of both Eimeria spp. and Toxoplasma gondii is overall high and comparable with findings from similar studies in other countries. Production system, husbandry and management conditions relate to increased risk of both mono- and co-infections, giving useful insights and indications for future studies, particularly in the light of increasing application of slow-growing, organic and “higher welfare” poultry farming practices. It could be shown that also in Greece there is a need for sustainable coccidiosis control, both in terms of Eimeria spp. infection control and of a minimization of T. gondii introduction to operations. A combination of the serological and molecular methods used in this study can contribute to earlier and more accurate diagnosis of Toxoplasma gondii infections in chickens, which is a crucial and sensitive subject for safeguarding transmission to humans.:Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Literature Review 2.1 Eimeria spp. 2.1.1 Life cycle 2.1.2 Diagnosis and control of Coccidiosis in chickens 2.1.3 Economic Impact of Coccidiosis 2.1.4 Prevalence of Eimeria spp. in chicken farms 2.1.5 Data of chicken coccidiosis from Greece 2.2 Toxoplasma gondii 2.2.1 Life cycle 2.2.2 Toxoplasmosis and Zoonotic Importance 2.2.3 Prevalence in poultry and risk factors 2.2.4 T. gondii data from Greece 2.3 Co-existence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii in chickens Chapter 3 - Overview of own scientific work 3.1 Aims 3.2 Presentation of own scientific work: Publications 3.2.1 Publication 1: Prevalence and molecular detection of Eimeria species in different types of poultry in Greece and associated risk factors. 3.2.2 Publication 2: Prevalence and molecular characterization of Toxoplasma gondii in different types of poultry in Greece, associated risk factors and co-existence with Eimeria spp. Chapter 4 - Overreaching Discussion Chapter 5 - Conclusions Chapter 6 - Summary Chapter 7 - Zusammenfassung Chapter 8 - References Acknowledgement

Coxiella burnetii Shedding in Milk and Molecular Typing of Strains Infecting Dairy Cows in Greece

Ruminants are considered the commonest animal reservoir for human infection of Coxiella burnetii, the Q fever causative agent. Considering the recently described importance of human Q fever in Greece, we aimed at providing the first comprehensive direct evidence of C. burnetii in dairy cows in Greece, including the genetic characterization of strains. The 462 examined dairy farms represented all geographical areas of Greece. One bulk tank milk sample was collected from every farm and tested for the presence of C. burnetii. Molecular genotyping of strains, performed directly on samples, revealed the existence of two separate clades characterized by single nucleotide polymorphism (SNP) genotypes of type 1 and type 2. The two clades were clearly distinguished in multiple locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) by two discriminative loci: MS30 and MS28. Whereas MLVA profiles of SNP-type 2 clade were closely related to strains described in other European cattle populations, the MLVA profile observed within the SNP type 1 clade highlighted a peculiar genetic signature for Greece, related to genotypes found in sheep and goats in Europe. The shedding of C. burnetii bearing this genotype might have yet undefined human epidemiological consequences. Surveillance of the genetic distribution of C. burnetii from different sources is needed to fully understand the epidemiology of Q fever in Greece

Economic and zoonotic importance of co-infection by Eimeria and Toxoplasma in chicken herds

Einleitung: Eimeria (E.) spp. und Toxoplasma (T.) gondii sind intrazelluläre Protozoen aus dem Phylum Apicomplexa und stellen bedeutende Pathogene dar. Infektionen mit Eimeria spp. sind Auslöser der Kokzidiose, welche eine der ökonomisch bedeutsamsten Erkrankungen in der Geflügelproduktion darstellt. Die Toxoplasmose des Huhnes hingegen verläuft in der Regel subklinisch. Da beide Parasiten, Eimeria spp. und Toxoplasma gondii, weltweit verbreitet sind, können natürliche Koinfektionen auftreten. Prävalenzstudien mit Hilfe molekularer und serologischer Untersuchungsmethoden sind geeignet, um die Vorkommen, Verbreitung, und Speziesidentität von einzelnen Apicomplexa zu untersuchen, was zu besserer Diagnose, Kontrolle, und Bestandsüberwachung beiträgt. Trotz vorliegender Hinweise, dass bei Koinfektionen zu einer Interaktion zwischen Eimeria und Toxoplasma kommt, existieren Erkenntnislücken hinsichtlich der Häufigkeit und der Bedeutung von natürlichen Koinfektionen des Huhnes unter Feldbedingungen, insbesondere mit Augenmerk auf verschiedene Nutzungstypen, Produktions- und Haltungsbedingungen. Ziele der Untersuchungen: Die Ziele der Untersuchungen waren die Erhebung der Prävalenzen von verschiedenen Eimeria spp. und von T. gondii bei Hühnern, sowie die Häufigkeit ihres Auftretens als Einzel- und Koinfektionen unter Feldbedingungen unter Berücksichtigung verschiedener Nutzungstypen und Haltungsbedingungen in Griechenland. Tiere, Material und Methoden: Die Auswahl der für diese Feldstudie untersuchten Hühnerbestände erfolgte auf Basis der Anzahl von kommerziellen Hühnerhaltungen in drei Hauptregionen Griechenlands. Nach offiziellen Angaben des griechischen Ministeriums für Ländliche Entwickung und Lebensmittel konzentriert sich die griechische Geflügelindustrie hauptsächlich auf Epirus (im Nordwesten), Zentralmazedonien, und Zentralgriechenland. Die Probenentnahme erfolgte in kommerziellen und Hinterhofhaltungen, wobei die Probenanzahl proportional zur Anzahl entsprechender Haltungsformen in der jeweiligen Region gewählt wurde (n = 50). Es wurden Legehennen (n = 21), langsam wachsende Broiler (n = 15) und Hinterhofhühner beprobt (n = 14), welche verschiedenen Produktions- und Haltungsbedingungen zugeordnet waren (Haltung in ausgestalteten Käfigen, Bodenhaltung mit Einstreu und Biohaltung). Konventionelle intensive Broileraufzuchten wurden nicht berücksichtigt. Für die Erhebung der Häufigkeiten von Eimeria spp.-Infektionen wurden aus allen ausgewählten Beständen Einstreuproben gesammelt (n = 756). Die Broilerherden wurden zu einem Zeitpunkt bei der Schlachtung erneut beprobt, indem die Därme der Einzeltiere gesammelt wurden (n = 162). Die Einstreu-/Darminhaltsproben wurden quantitativ mittels McMaster-Verfahrens auf den Eimeria spp.-Oozystengehalt (als Oozysten pro Gramm Kot, OPG) untersucht. Die Eimeria-Oozysten aus positiven Proben wurden für weitere molekulare Analysen aufgereinigt und aufbewahrt. Die Eimeria-Speziesbestimmung erfolgte durch spezies-spezifische DNA-Nachweise, und die Quantifizierung der einzelnen Arten erfolgte semiquantitativ. Um die Häufigkeit von T. gondii-Infektionen zu bestimmen, wurden Blutproben (n = 1,021) von Einzeltieren zur serologischen Untersuchung mittels TgSAG1 ELISA entnommen, zeitgleich zur o. g. Beprobung der Bestände für die Einstreuproben. Für Hinterhofhaltungen mit Tieren variablen Alters wurden ältere Tiere bevorzugt beprobt, und in kommerziellen Legehennenhaltungen wurden die Tiere im Alter von ca. 10 Monaten beprobt. In beiden Fällen wurden von T. gondii-seropositiven Tieren bei der Schlachtung die Herzen gewonnen (n = 322). In Broilerhaltungen wurden ebenfalls Blutproben und das Herz während des Schlachtungsprozesses zum T. gondii-Nachweis entnommen. Das Herzgewebe wurde in einer magnetic capture Polymerasekettenreaktion (mc-PCR) sowie einem Mausbioassay auf Präsenz und Genotyp einzelner Isolate untersucht. Parallel zu den Laboruntersuchungen wurden Daten zu Haltungsbedingungen, Biosicherheitsmaβnahmen, Lage, Bestandsgröβe, Krankheitsgeschichte etc. mittels standardisierter Fragebögen erfasst, um potenzielle Risikofaktoren für Eimerien- und/oder T. gondii-Infektionen zu bestimmen. Die Datenanalyse erfolgte durch Multilevel-Modelling (generalized linear mixed modelling fit by maximum likelihood (Laplace approximation)) mittels dem R-Programm (https://www.r-project.org, Version 4.0.2, Paket lme4), dem Kruskal-Wallis-Test und bivariaten Spearman-Korrelationen im PSPP-Prgramm (GNU PSPP 1.3.0). Ergebnisse: Insgesamt lag die Nachweisrate für Eimeria spp.-Infektionen bei 85,7 %. Alle sieben Hühnereimerienspezies wurden identifiziert, wobei E. acervulina (79,3 %) und E. tenella (65,5 %) die höchste Prävalenz aufwiesen. Infektionen mit mehreren Eimeria-Arten (79,3 %) waren deutlich häufiger anzutreffen als Einzelinfektionen (20,7 %). Als Risikofaktoren wurden Herdengröβe, Art des Auslaufs und Produktionssystem identifiziert. Zwischen respiratorischen Erkrankungen und mittlerer OPG wurde in Broilerhaltungen eine sehr starke Korrelation beobachtet (P < 0.001). Biohaltungen zeigten eine höhere Prävalenz von E. tenella (P = 0,023). Nutzung einer bewachsenen Auslauffläche war stark mit der Präsenz von E. brunetti korreliert (P < 0,001). Die T. gondii-Seroprävalenz über alle untersuchten Tiere betrug 9,5 %. Dabei testeten 41,2 % aller Hinterhofhühner seropositive. In 70 % der Bio- und Freilaufhaltungen wurde mindestens ein Tier seropositiv getestet. Es wurden keine T. gondii-seropositiven Broiler gefunden, obwohl mit Hilfe der mc-PCR positive DNA-Nachweise erfolgten. Dies belegt die hohe Sensitivität der mc-PCR und ihre potenzielle Eignung für die Detektion früher Infektionen bei Hühnern. Die T. gondii-Isolate, welche im Mausbioassay gewonnen wurden, wurden als Typ II (ToxoDB#3) genotypisiert, was durch Mikrosatellitenanalyse bestätigt wurde. Für T. gondii-Infektionen wurden Produktionssystem und Futterautomatisierung als Risikofaktoren identifiziert, wobei Auslaufbeweidung die Wahrscheinlichkeit für T. gondii-Infektionen erhöht. Die Gegenwart von Katzen stellte hingegen keinen nachweisbaren Risikofaktor für T. gondii-Seropositivität auf Bestands- oder Einzeltierniveau dar. Koinfektionen mit beiden Protozoen wurden in 87% aller untersuchten Hühnerbestände nachgewiesen, wobei Hinterhof-, Bio-, und Freilandhaltungen am häufigsten betroffen waren. In den moisten Fällen von Koinfektionen wurde E. acervulina nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Die Prävalenz sowohl von Eimeria spp. als auch von T. gondii war generell hoch und auf einem vergleichbaren Niveau mit den Ergebnissen früherer Studien in anderen Ländern. Faktoren wie Produktionssystem, Haltungs- und Managementbedingungen sind mit dem Risiko von Mono- oder Koinfektionen verbunden. Die gewonnenen Erkenntisse erlauben die gezielte Planung zukünftiger Studien hinsichtlich sich ändernder Haltungsbedingungen, z. B. dem Trend zur verstärkten Bio- und tierfreundlichen Hühnerhaltung uns dem Einsatz langsam wachsender Rassen. Es besteht auch in Griechenland ein Bedarf an nachhaltiger Kontrolle von Kokzidieninfektionen, einschlieβlich der Minimierung zoonotischer Erreger wie T. gondii in Nutztierbeständen. Die verwendeten serologischen und molekularen Methoden können nach den Studienerkenntnisse ausserdem zur frühzeitigen Überwachung von T. gondii–Infektionen in Hühnerbeständen beitragen.:Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Literature Review 2.1 Eimeria spp. 2.1.1 Life cycle 2.1.2 Diagnosis and control of Coccidiosis in chickens 2.1.3 Economic Impact of Coccidiosis 2.1.4 Prevalence of Eimeria spp. in chicken farms 2.1.5 Data of chicken coccidiosis from Greece 2.2 Toxoplasma gondii 2.2.1 Life cycle 2.2.2 Toxoplasmosis and Zoonotic Importance 2.2.3 Prevalence in poultry and risk factors 2.2.4 T. gondii data from Greece 2.3 Co-existence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii in chickens Chapter 3 - Overview of own scientific work 3.1 Aims 3.2 Presentation of own scientific work: Publications 3.2.1 Publication 1: Prevalence and molecular detection of Eimeria species in different types of poultry in Greece and associated risk factors. 3.2.2 Publication 2: Prevalence and molecular characterization of Toxoplasma gondii in different types of poultry in Greece, associated risk factors and co-existence with Eimeria spp. Chapter 4 - Overreaching Discussion Chapter 5 - Conclusions Chapter 6 - Summary Chapter 7 - Zusammenfassung Chapter 8 - References AcknowledgementsIntroduction: Eimeria spp. and Toxoplasma gondii are intracellular Apicomplexan protozoa and represent important pathogens for chickens. Coccidiosis, caused by Eimeria spp. is one of the most notable diseases in chickens having a high economic impact on the poultry industry worldwide, while toxoplasmosis is usually subclinical in these hosts. As both Eimeria spp and Toxoplasma gondii have a broad worldwide distribution, natural co-infections in chickens can occur. Prevalence studies using molecular and serological techniques have proven a very useful approach to study the diversity and distribution of these parasites’ mono-infections, further contributing to more efficient diagnosis, control and monitoring. Despite existing indications that these two parasites interact when the host is infected simultaneously, there are still knowledge gaps regarding the frequency and impact of naturally occurring co-infections under field conditions, particularly in different types of poultry, production and housing systems. Objective: Determination of the level of occurrence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii mono- and co-infections under field conditions, in different types of chickens and farm profiles in Greece. Animals, materials and methods: Selection of poultry operations was based on the number of commercial farms in three major Greek regions, as poultry farms in Greece are highly concentrated in Epirus (in North-Western Greece), Central Macedonia, and Central Greece, based on the data from the Hellenic Ministry of Rural Development and Food. Sampling from both commercial operations and backyard farms was conducted proportionately to their frequency (n=50) and type of flocks included in the study were layers (n=21), slow-growing broilers (n=15) and backyard chickens (n=14), under different production and housing systems (enriched cages, floor-housed in litter, free-range and organic systems). Conventional intensively reared broilers were not included in the study. To record Eimeria spp. occurrence, faecal samples were collected from the litter of the chicken housing (n=756). Broiler flocks were followed up to the slaughterhouse for a second sampling where the whole gut was collected (n=162). Samples were quantitatively examined by a modified McMaster technique to calculate oocysts per gram (OPG) of faeces, followed by collection and purification of the oocysts for further molecular analysis. Species identification was performed by multiple PCR assays using species-specific primers and PCR bands were categorized by intensity semiquantitavely. To record Toxoplasma gondii infections, simultaneously to faecal sampling, blood samples (n=1,021) were also collected from individual animals for serological T. gondii detection via TgSAG1 ELISA. In our sampled broiler flocks, animals were sampled at slaughter, where blood samples and the heart were collected for T. gondii detection. In backyard flocks, blood samples were taken from the older animals and in layers from individual animals (at the age of approximately 10 months). Toxoplasma positive animals were followed up to slaughter to collect heart tissue (n=322), further processed for bioassay in KO mice and mc-PCR in order to characterize Toxoplasma gondii isolates. In parallel, potential risk factors and impact regarding mono- and co-infection of both parasites were investigated through an obtained questionnaire containing additional information about farm management, biosecurity status, location, production rate and diseases history. For the data analysis a multilevel-modelling (generalized linear mixed modelling fit by maximum likelihood (Laplace approximation)) was performed using R (https://www.r-project.org) version 4.0.2, by applying the package lme4, as well as Kruskal-Wallis tests and bivariate correlations in PSPP statistical program (GNU PSPP 1.3.0). Results: Overall Eimeria spp. positivity level was 85.7%. All seven Eimeria species were identified with E. acervulina (79.3%) and E. tenella (65.5%) being the most prevalent ones. Mixed infections (79.3%) were more common than single-species (20.7%) Significant identified risk factors were flock size, type of outdoor area, and production system. A very strong correlation (p < 0.001) was found between the presence of respiratory disease and the average OPG level in broiler farms. Organic flocks showed higher prevalence of E. tenella (p = 0.023), while presence of vegetation at the outdoor area correlated strongly with E. brunetti (p < 0.001). Toxoplasma gondii seroprevalence was 9.5%. 41.2% of the backyard chickens sampled were seropositive and 70% of the organic and free-range layer farms had at least one Toxoplasma gondii seropositive hen. No serologically positive broilers were found, however mc-PCR revealed positive samples, stressing out the high sensitivity and potential contribution of this method in early detection of the parasite. Toxoplasma gondii isolates obtained by mouse bioassay were genotyped and found to belong to type II (ToxoDB#3) as confirmed also by microsatellite typing. The most significant risk factors were production system and feeding system automation, with free-grazing practices increasing the likelihood for Toxoplasma infections. Presence of cats showed no association with Toxoplasma gondii seropositivity on a farm and individual animal level. The two protozoan parasites were found to co-exist in 87% of the studied poultry operations, with backyard, organic and free-range farms showing the highest occurrence. E. acervulina was the species identified in most of the co-existence cases. Conclusions: Prevalence of both Eimeria spp. and Toxoplasma gondii is overall high and comparable with findings from similar studies in other countries. Production system, husbandry and management conditions relate to increased risk of both mono- and co-infections, giving useful insights and indications for future studies, particularly in the light of increasing application of slow-growing, organic and “higher welfare” poultry farming practices. It could be shown that also in Greece there is a need for sustainable coccidiosis control, both in terms of Eimeria spp. infection control and of a minimization of T. gondii introduction to operations. A combination of the serological and molecular methods used in this study can contribute to earlier and more accurate diagnosis of Toxoplasma gondii infections in chickens, which is a crucial and sensitive subject for safeguarding transmission to humans.:Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Literature Review 2.1 Eimeria spp. 2.1.1 Life cycle 2.1.2 Diagnosis and control of Coccidiosis in chickens 2.1.3 Economic Impact of Coccidiosis 2.1.4 Prevalence of Eimeria spp. in chicken farms 2.1.5 Data of chicken coccidiosis from Greece 2.2 Toxoplasma gondii 2.2.1 Life cycle 2.2.2 Toxoplasmosis and Zoonotic Importance 2.2.3 Prevalence in poultry and risk factors 2.2.4 T. gondii data from Greece 2.3 Co-existence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii in chickens Chapter 3 - Overview of own scientific work 3.1 Aims 3.2 Presentation of own scientific work: Publications 3.2.1 Publication 1: Prevalence and molecular detection of Eimeria species in different types of poultry in Greece and associated risk factors. 3.2.2 Publication 2: Prevalence and molecular characterization of Toxoplasma gondii in different types of poultry in Greece, associated risk factors and co-existence with Eimeria spp. Chapter 4 - Overreaching Discussion Chapter 5 - Conclusions Chapter 6 - Summary Chapter 7 - Zusammenfassung Chapter 8 - References Acknowledgement

Economic and zoonotic importance of co-infection by Eimeria and Toxoplasma in chicken herds

Einleitung: Eimeria (E.) spp. und Toxoplasma (T.) gondii sind intrazelluläre Protozoen aus dem Phylum Apicomplexa und stellen bedeutende Pathogene dar. Infektionen mit Eimeria spp. sind Auslöser der Kokzidiose, welche eine der ökonomisch bedeutsamsten Erkrankungen in der Geflügelproduktion darstellt. Die Toxoplasmose des Huhnes hingegen verläuft in der Regel subklinisch. Da beide Parasiten, Eimeria spp. und Toxoplasma gondii, weltweit verbreitet sind, können natürliche Koinfektionen auftreten. Prävalenzstudien mit Hilfe molekularer und serologischer Untersuchungsmethoden sind geeignet, um die Vorkommen, Verbreitung, und Speziesidentität von einzelnen Apicomplexa zu untersuchen, was zu besserer Diagnose, Kontrolle, und Bestandsüberwachung beiträgt. Trotz vorliegender Hinweise, dass bei Koinfektionen zu einer Interaktion zwischen Eimeria und Toxoplasma kommt, existieren Erkenntnislücken hinsichtlich der Häufigkeit und der Bedeutung von natürlichen Koinfektionen des Huhnes unter Feldbedingungen, insbesondere mit Augenmerk auf verschiedene Nutzungstypen, Produktions- und Haltungsbedingungen. Ziele der Untersuchungen: Die Ziele der Untersuchungen waren die Erhebung der Prävalenzen von verschiedenen Eimeria spp. und von T. gondii bei Hühnern, sowie die Häufigkeit ihres Auftretens als Einzel- und Koinfektionen unter Feldbedingungen unter Berücksichtigung verschiedener Nutzungstypen und Haltungsbedingungen in Griechenland. Tiere, Material und Methoden: Die Auswahl der für diese Feldstudie untersuchten Hühnerbestände erfolgte auf Basis der Anzahl von kommerziellen Hühnerhaltungen in drei Hauptregionen Griechenlands. Nach offiziellen Angaben des griechischen Ministeriums für Ländliche Entwickung und Lebensmittel konzentriert sich die griechische Geflügelindustrie hauptsächlich auf Epirus (im Nordwesten), Zentralmazedonien, und Zentralgriechenland. Die Probenentnahme erfolgte in kommerziellen und Hinterhofhaltungen, wobei die Probenanzahl proportional zur Anzahl entsprechender Haltungsformen in der jeweiligen Region gewählt wurde (n = 50). Es wurden Legehennen (n = 21), langsam wachsende Broiler (n = 15) und Hinterhofhühner beprobt (n = 14), welche verschiedenen Produktions- und Haltungsbedingungen zugeordnet waren (Haltung in ausgestalteten Käfigen, Bodenhaltung mit Einstreu und Biohaltung). Konventionelle intensive Broileraufzuchten wurden nicht berücksichtigt. Für die Erhebung der Häufigkeiten von Eimeria spp.-Infektionen wurden aus allen ausgewählten Beständen Einstreuproben gesammelt (n = 756). Die Broilerherden wurden zu einem Zeitpunkt bei der Schlachtung erneut beprobt, indem die Därme der Einzeltiere gesammelt wurden (n = 162). Die Einstreu-/Darminhaltsproben wurden quantitativ mittels McMaster-Verfahrens auf den Eimeria spp.-Oozystengehalt (als Oozysten pro Gramm Kot, OPG) untersucht. Die Eimeria-Oozysten aus positiven Proben wurden für weitere molekulare Analysen aufgereinigt und aufbewahrt. Die Eimeria-Speziesbestimmung erfolgte durch spezies-spezifische DNA-Nachweise, und die Quantifizierung der einzelnen Arten erfolgte semiquantitativ. Um die Häufigkeit von T. gondii-Infektionen zu bestimmen, wurden Blutproben (n = 1,021) von Einzeltieren zur serologischen Untersuchung mittels TgSAG1 ELISA entnommen, zeitgleich zur o. g. Beprobung der Bestände für die Einstreuproben. Für Hinterhofhaltungen mit Tieren variablen Alters wurden ältere Tiere bevorzugt beprobt, und in kommerziellen Legehennenhaltungen wurden die Tiere im Alter von ca. 10 Monaten beprobt. In beiden Fällen wurden von T. gondii-seropositiven Tieren bei der Schlachtung die Herzen gewonnen (n = 322). In Broilerhaltungen wurden ebenfalls Blutproben und das Herz während des Schlachtungsprozesses zum T. gondii-Nachweis entnommen. Das Herzgewebe wurde in einer magnetic capture Polymerasekettenreaktion (mc-PCR) sowie einem Mausbioassay auf Präsenz und Genotyp einzelner Isolate untersucht. Parallel zu den Laboruntersuchungen wurden Daten zu Haltungsbedingungen, Biosicherheitsmaβnahmen, Lage, Bestandsgröβe, Krankheitsgeschichte etc. mittels standardisierter Fragebögen erfasst, um potenzielle Risikofaktoren für Eimerien- und/oder T. gondii-Infektionen zu bestimmen. Die Datenanalyse erfolgte durch Multilevel-Modelling (generalized linear mixed modelling fit by maximum likelihood (Laplace approximation)) mittels dem R-Programm (https://www.r-project.org, Version 4.0.2, Paket lme4), dem Kruskal-Wallis-Test und bivariaten Spearman-Korrelationen im PSPP-Prgramm (GNU PSPP 1.3.0). Ergebnisse: Insgesamt lag die Nachweisrate für Eimeria spp.-Infektionen bei 85,7 %. Alle sieben Hühnereimerienspezies wurden identifiziert, wobei E. acervulina (79,3 %) und E. tenella (65,5 %) die höchste Prävalenz aufwiesen. Infektionen mit mehreren Eimeria-Arten (79,3 %) waren deutlich häufiger anzutreffen als Einzelinfektionen (20,7 %). Als Risikofaktoren wurden Herdengröβe, Art des Auslaufs und Produktionssystem identifiziert. Zwischen respiratorischen Erkrankungen und mittlerer OPG wurde in Broilerhaltungen eine sehr starke Korrelation beobachtet (P < 0.001). Biohaltungen zeigten eine höhere Prävalenz von E. tenella (P = 0,023). Nutzung einer bewachsenen Auslauffläche war stark mit der Präsenz von E. brunetti korreliert (P < 0,001). Die T. gondii-Seroprävalenz über alle untersuchten Tiere betrug 9,5 %. Dabei testeten 41,2 % aller Hinterhofhühner seropositive. In 70 % der Bio- und Freilaufhaltungen wurde mindestens ein Tier seropositiv getestet. Es wurden keine T. gondii-seropositiven Broiler gefunden, obwohl mit Hilfe der mc-PCR positive DNA-Nachweise erfolgten. Dies belegt die hohe Sensitivität der mc-PCR und ihre potenzielle Eignung für die Detektion früher Infektionen bei Hühnern. Die T. gondii-Isolate, welche im Mausbioassay gewonnen wurden, wurden als Typ II (ToxoDB#3) genotypisiert, was durch Mikrosatellitenanalyse bestätigt wurde. Für T. gondii-Infektionen wurden Produktionssystem und Futterautomatisierung als Risikofaktoren identifiziert, wobei Auslaufbeweidung die Wahrscheinlichkeit für T. gondii-Infektionen erhöht. Die Gegenwart von Katzen stellte hingegen keinen nachweisbaren Risikofaktor für T. gondii-Seropositivität auf Bestands- oder Einzeltierniveau dar. Koinfektionen mit beiden Protozoen wurden in 87% aller untersuchten Hühnerbestände nachgewiesen, wobei Hinterhof-, Bio-, und Freilandhaltungen am häufigsten betroffen waren. In den moisten Fällen von Koinfektionen wurde E. acervulina nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Die Prävalenz sowohl von Eimeria spp. als auch von T. gondii war generell hoch und auf einem vergleichbaren Niveau mit den Ergebnissen früherer Studien in anderen Ländern. Faktoren wie Produktionssystem, Haltungs- und Managementbedingungen sind mit dem Risiko von Mono- oder Koinfektionen verbunden. Die gewonnenen Erkenntisse erlauben die gezielte Planung zukünftiger Studien hinsichtlich sich ändernder Haltungsbedingungen, z. B. dem Trend zur verstärkten Bio- und tierfreundlichen Hühnerhaltung uns dem Einsatz langsam wachsender Rassen. Es besteht auch in Griechenland ein Bedarf an nachhaltiger Kontrolle von Kokzidieninfektionen, einschlieβlich der Minimierung zoonotischer Erreger wie T. gondii in Nutztierbeständen. Die verwendeten serologischen und molekularen Methoden können nach den Studienerkenntnisse ausserdem zur frühzeitigen Überwachung von T. gondii–Infektionen in Hühnerbeständen beitragen.:Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Literature Review 2.1 Eimeria spp. 2.1.1 Life cycle 2.1.2 Diagnosis and control of Coccidiosis in chickens 2.1.3 Economic Impact of Coccidiosis 2.1.4 Prevalence of Eimeria spp. in chicken farms 2.1.5 Data of chicken coccidiosis from Greece 2.2 Toxoplasma gondii 2.2.1 Life cycle 2.2.2 Toxoplasmosis and Zoonotic Importance 2.2.3 Prevalence in poultry and risk factors 2.2.4 T. gondii data from Greece 2.3 Co-existence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii in chickens Chapter 3 - Overview of own scientific work 3.1 Aims 3.2 Presentation of own scientific work: Publications 3.2.1 Publication 1: Prevalence and molecular detection of Eimeria species in different types of poultry in Greece and associated risk factors. 3.2.2 Publication 2: Prevalence and molecular characterization of Toxoplasma gondii in different types of poultry in Greece, associated risk factors and co-existence with Eimeria spp. Chapter 4 - Overreaching Discussion Chapter 5 - Conclusions Chapter 6 - Summary Chapter 7 - Zusammenfassung Chapter 8 - References AcknowledgementsIntroduction: Eimeria spp. and Toxoplasma gondii are intracellular Apicomplexan protozoa and represent important pathogens for chickens. Coccidiosis, caused by Eimeria spp. is one of the most notable diseases in chickens having a high economic impact on the poultry industry worldwide, while toxoplasmosis is usually subclinical in these hosts. As both Eimeria spp and Toxoplasma gondii have a broad worldwide distribution, natural co-infections in chickens can occur. Prevalence studies using molecular and serological techniques have proven a very useful approach to study the diversity and distribution of these parasites’ mono-infections, further contributing to more efficient diagnosis, control and monitoring. Despite existing indications that these two parasites interact when the host is infected simultaneously, there are still knowledge gaps regarding the frequency and impact of naturally occurring co-infections under field conditions, particularly in different types of poultry, production and housing systems. Objective: Determination of the level of occurrence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii mono- and co-infections under field conditions, in different types of chickens and farm profiles in Greece. Animals, materials and methods: Selection of poultry operations was based on the number of commercial farms in three major Greek regions, as poultry farms in Greece are highly concentrated in Epirus (in North-Western Greece), Central Macedonia, and Central Greece, based on the data from the Hellenic Ministry of Rural Development and Food. Sampling from both commercial operations and backyard farms was conducted proportionately to their frequency (n=50) and type of flocks included in the study were layers (n=21), slow-growing broilers (n=15) and backyard chickens (n=14), under different production and housing systems (enriched cages, floor-housed in litter, free-range and organic systems). Conventional intensively reared broilers were not included in the study. To record Eimeria spp. occurrence, faecal samples were collected from the litter of the chicken housing (n=756). Broiler flocks were followed up to the slaughterhouse for a second sampling where the whole gut was collected (n=162). Samples were quantitatively examined by a modified McMaster technique to calculate oocysts per gram (OPG) of faeces, followed by collection and purification of the oocysts for further molecular analysis. Species identification was performed by multiple PCR assays using species-specific primers and PCR bands were categorized by intensity semiquantitavely. To record Toxoplasma gondii infections, simultaneously to faecal sampling, blood samples (n=1,021) were also collected from individual animals for serological T. gondii detection via TgSAG1 ELISA. In our sampled broiler flocks, animals were sampled at slaughter, where blood samples and the heart were collected for T. gondii detection. In backyard flocks, blood samples were taken from the older animals and in layers from individual animals (at the age of approximately 10 months). Toxoplasma positive animals were followed up to slaughter to collect heart tissue (n=322), further processed for bioassay in KO mice and mc-PCR in order to characterize Toxoplasma gondii isolates. In parallel, potential risk factors and impact regarding mono- and co-infection of both parasites were investigated through an obtained questionnaire containing additional information about farm management, biosecurity status, location, production rate and diseases history. For the data analysis a multilevel-modelling (generalized linear mixed modelling fit by maximum likelihood (Laplace approximation)) was performed using R (https://www.r-project.org) version 4.0.2, by applying the package lme4, as well as Kruskal-Wallis tests and bivariate correlations in PSPP statistical program (GNU PSPP 1.3.0). Results: Overall Eimeria spp. positivity level was 85.7%. All seven Eimeria species were identified with E. acervulina (79.3%) and E. tenella (65.5%) being the most prevalent ones. Mixed infections (79.3%) were more common than single-species (20.7%) Significant identified risk factors were flock size, type of outdoor area, and production system. A very strong correlation (p < 0.001) was found between the presence of respiratory disease and the average OPG level in broiler farms. Organic flocks showed higher prevalence of E. tenella (p = 0.023), while presence of vegetation at the outdoor area correlated strongly with E. brunetti (p < 0.001). Toxoplasma gondii seroprevalence was 9.5%. 41.2% of the backyard chickens sampled were seropositive and 70% of the organic and free-range layer farms had at least one Toxoplasma gondii seropositive hen. No serologically positive broilers were found, however mc-PCR revealed positive samples, stressing out the high sensitivity and potential contribution of this method in early detection of the parasite. Toxoplasma gondii isolates obtained by mouse bioassay were genotyped and found to belong to type II (ToxoDB#3) as confirmed also by microsatellite typing. The most significant risk factors were production system and feeding system automation, with free-grazing practices increasing the likelihood for Toxoplasma infections. Presence of cats showed no association with Toxoplasma gondii seropositivity on a farm and individual animal level. The two protozoan parasites were found to co-exist in 87% of the studied poultry operations, with backyard, organic and free-range farms showing the highest occurrence. E. acervulina was the species identified in most of the co-existence cases. Conclusions: Prevalence of both Eimeria spp. and Toxoplasma gondii is overall high and comparable with findings from similar studies in other countries. Production system, husbandry and management conditions relate to increased risk of both mono- and co-infections, giving useful insights and indications for future studies, particularly in the light of increasing application of slow-growing, organic and “higher welfare” poultry farming practices. It could be shown that also in Greece there is a need for sustainable coccidiosis control, both in terms of Eimeria spp. infection control and of a minimization of T. gondii introduction to operations. A combination of the serological and molecular methods used in this study can contribute to earlier and more accurate diagnosis of Toxoplasma gondii infections in chickens, which is a crucial and sensitive subject for safeguarding transmission to humans.:Chapter 1 - Introduction Chapter 2 - Literature Review 2.1 Eimeria spp. 2.1.1 Life cycle 2.1.2 Diagnosis and control of Coccidiosis in chickens 2.1.3 Economic Impact of Coccidiosis 2.1.4 Prevalence of Eimeria spp. in chicken farms 2.1.5 Data of chicken coccidiosis from Greece 2.2 Toxoplasma gondii 2.2.1 Life cycle 2.2.2 Toxoplasmosis and Zoonotic Importance 2.2.3 Prevalence in poultry and risk factors 2.2.4 T. gondii data from Greece 2.3 Co-existence of Eimeria spp. and Toxoplasma gondii in chickens Chapter 3 - Overview of own scientific work 3.1 Aims 3.2 Presentation of own scientific work: Publications 3.2.1 Publication 1: Prevalence and molecular detection of Eimeria species in different types of poultry in Greece and associated risk factors. 3.2.2 Publication 2: Prevalence and molecular characterization of Toxoplasma gondii in different types of poultry in Greece, associated risk factors and co-existence with Eimeria spp. Chapter 4 - Overreaching Discussion Chapter 5 - Conclusions Chapter 6 - Summary Chapter 7 - Zusammenfassung Chapter 8 - References Acknowledgement

First Identification and Molecular Characterization of Avian metapneumovirus Subtype B from Chickens in Greece

Avian metapneumovirus (aMPV) is considered a major pathogen for turkeys but its impact on chicken production is still partially neglected, even though it is fully acknowledged as a primary pathogen in chickens as well. The lack of structured diagnostic surveys does not allow a pervasive understanding of aMPV epidemiology. Being that aMPV is almost an everyday challenge for farmers and veterinarians, a more accurate report of its presence should be detailed, posing the basis for a deep and global epidemiologic analysis. With these premises, the present work aims to report the first detection and molecular characterization of aMPV subtype B field strains from unvaccinated chickens in Greece. The Greek strains appear to be phylogenetically related among each other and with other recent Mediterranean strains while being distant from the currently applied vaccines, thus stressing once more the necessity to evaluate aMPV diffusion and evolution

Coxiella burnetii Shedding in Milk and Molecular Typing of Strains Infecting Dairy Cows in Greece

Ruminants are considered the commonest animal reservoir for human infection of Coxiella burnetii, the Q fever causative agent. Considering the recently described importance of human Q fever in Greece, we aimed at providing the first comprehensive direct evidence of C. burnetii in dairy cows in Greece, including the genetic characterization of strains. The 462 examined dairy farms represented all geographical areas of Greece. One bulk tank milk sample was collected from every farm and tested for the presence of C. burnetii. Molecular genotyping of strains, performed directly on samples, revealed the existence of two separate clades characterized by single nucleotide polymorphism (SNP) genotypes of type 1 and type 2. The two clades were clearly distinguished in multiple locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) by two discriminative loci: MS30 and MS28. Whereas MLVA profiles of SNP-type 2 clade were closely related to strains described in other European cattle populations, the MLVA profile observed within the SNP type 1 clade highlighted a peculiar genetic signature for Greece, related to genotypes found in sheep and goats in Europe. The shedding of C. burnetii bearing this genotype might have yet undefined human epidemiological consequences. Surveillance of the genetic distribution of C. burnetii from different sources is needed to fully understand the epidemiology of Q fever in Greece

Coxiella burnetii Shedding in Milk and Molecular Typing of Strains Infecting Dairy Cows in Greece

Ruminants are considered the commonest animal reservoir for human infection of Coxiella burnetii, the Q fever causative agent. Considering the recently described importance of human Q fever in Greece, we aimed at providing the first comprehensive direct evidence of C. burnetii in dairy cows in Greece, including the genetic characterization of strains. The 462 examined dairy farms represented all geographical areas of Greece. One bulk tank milk sample was collected from every farm and tested for the presence of C. burnetii. Molecular genotyping of strains, performed directly on samples, revealed the existence of two separate clades characterized by single nucleotide polymorphism (SNP) genotypes of type 1 and type 2. The two clades were clearly distinguished in multiple locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA) by two discriminative loci: MS30 and MS28. Whereas MLVA profiles of SNP-type 2 clade were closely related to strains described in other European cattle populations, the MLVA profile observed within the SNP type 1 clade highlighted a peculiar genetic signature for Greece, related to genotypes found in sheep and goats in Europe. The shedding of C. burnetii bearing this genotype might have yet undefined human epidemiological consequences. Surveillance of the genetic distribution of C. burnetii from different sources is needed to fully understand the epidemiology of Q fever in Greece