Variabilidade genética do canal de sódio voltagem-dependente em populações naturais de Aedes aegypti e Aedes albopictus da Colômbia e do Brasil : importantes mosquitos vetores de arbovírus

Orientador : Prof. Dr. Mário Antônio Navarro da SilvaCoorientador : Dr. Ademir de Jesus Martins JuniorTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Entomologia). Defesa: Curitiba, 17/11/2016Inclui referências: f. 81-98Área de concentração : EntomologiaResumo: O canal de sódio voltagem-dependente (NaV) é fundamental para a sinalização elétrica no sistema nervoso e é o sítio-alvo para Piretróides (PY) e DDT. A resistência knockdown (kdr), causada por alterações no NaV, é portanto, um dos mecanismos que confere resistência a estes inseticidas. Pelo menos 12 mutações não sinônimas foram relatadas em nove códons diferentes no gene do NaV em Aedes aegypti, a maioria delas nos segmentos IIS6 e IIIS6. A mutação kdr Phe1534Cys no segmento IIIS6 é a mais prevalente em todo o mundo, e também foi encontrada em populações asiáticas de Aedes albopictus resistente aos PY. Aqui foi investigada a ocorrência, frequência e distribuição de mutações kdr presentes nos segmentos IIS6 e IIIS6 do NaV em populações naturais de A. aegypti da Colômbia e Brasil e de A. albopictus do Brasil. O DNA de 13 populações de A. aegypti da Colômbia (quatro) e Brasil (nove) e nove de A.albopictus do Brasil foram individualmente extraídos e agrupados por Estado (A.aegypti) e localidade (A. albopictus), amplificados, clonados e sequenciados para os correspondentes segmentos IIS6 e IIIS6 do NaV. Adicionalmente, os indivíduos de cada espécie, para cada localidade foram individualmente genotipados via PCR alelo específica (AS-PCR) para se obter as frequências genotípicas e alélicas para os sítios kdr 1016 e 1534 para A. aegypti, e 1534 para A. albopictus. A área urbana de Foz do Iguaçu foi dividida por estratos, de forma que as frequências genotípicas e alélicas foram então analisadas separadamente e, em seguida, como uma unidade. Nas populações de A. aegypti de ambos os países foram detectados três polimorfismos não sinônimos no NaV (Ile1011Met, Val1016Ile no segmento IIS6 e Phe1534Cys no IIIS6). Já em A. albopictus apenas a mutação Phe1534Cys foi evidenciada em populações brasileiras dos Estados de Paraná (PR) e Rondônia (RO). Substituições restritas ao sítio 1534 (NaV R1) e substituições simultâneas em ambos os sítios 1016 e 1534 (NaV R2) foram observadas em todas as populações de A. aegypti da Colômbia e Brasil. O alelo kdr NaV R1 foi detectado em todas as localidades da Colômbia e Brasil. No Brasil, o alelo kdr NaV R2 foi mais frequente nas localidades da região Sul e Centro-Oeste. Em Foz do Iguaçu, o alelo kdr NaV R2 estava distribuido nos estratos em frequências ?55%, com exceção do estrato 1. Por sua parte, em A. albopictus, o alelo 1534Cyskdr variou entre 3% (Marilena/PR e Porto Velho/RO) e 10% (Foz do Iguaçu/PR). Esta é a primeira evidencia de ocorrência e distribuição de uma mutação kdr em A. albopictus para América do Sul. Os resultados aqui apresentados sugerem a necessidade de um uso integrado apropriado de inseticidas na Colômbia e no Brasil, assim como a inclusão de A. albopictus no monitoramento da resistência aos inseticidas, a fim de manter os compostos químicos como uma ferramenta de controle de vetores quando necessário. Palavras-chave: chikungunya, dengue, piretróides, controle vetorial, canal de sódio voltagem-dependente, Zika.Abstract: The voltage-gated sodium channel (NaV) is critical for electrical signaling in the nervous system and is the target site for Pyrethroids (PY) and DDT. The knockdown resistance (kdr) caused by changes in NaV, is one of the mechanisms that confers resistance to those insecticides. At least 12 non-synonymous mutations were reported at nine different codons in the NaV gene in Aedes aegypti, most of them in the segments IIS6 and IIIS6. The kdr mutation Phe1534Cys in IIIS6 NaV segment is the most prevalent throughout the world, and has also been found in Asian Aedes albopictus populations resistant to PY. Here, we studied the occurrence, frequency and distribution of kdr mutations present in the IIS6 and IIIS6 NaV segments in natural populations of A.aegypti from Colombia and Brazil and A. albopictus from Brazil. The DNA from 13 A. aegypti populations from Colombia (four) and Brazil (nine) and nine from A. albopictus from Brazil were individually extracted and grouped by State (A. aegypti) and location (A. albopictus), amplified, cloned and sequenced to the corresponding IIS6 and IIIS6 NaV segment. In addition, individuals from each location for each species were individually genotyped using PCR specific allele (AS-PCR) for obtaining the genotypic and allelic frequencies for the kdr sites 1016 and 1534 for A. aegypti and 1534 for A.albopictus. The urban area of Foz do Iguaçu was divided by strata, and genotypic and allelic frequencies were analyzed, first by strata and then as a single unit. In A. aegyptipopulations from both countries three non-synonymous polymorphisms (Ile1011Met, Val1016Ile in IIS6 and Phe1534Cys in IIIS6 NaV segment) in the NaV gene were detected. However, in A. albopictus, only the Phe1534Cys kdr mutation was evidenced in Brazilian populations' from the states of Paraná (PR) and Rondônia (RO). Restricted substitutions to 1534 site (NaV R1) and simultaneous substitutions at both 1016 and 1534 sites in (NaV R2) were observed in all A. aegypti populations from Colombia and Brazil. The NaV R1 kdr allele was detected in all locations from Colombia and Brazil. In Brazil, the NaV R2 kdr allele was more frequent in the localities from the South and Central West. In Foz do Iguaçu, the NaV R2 kdr allele was spread in all strata in frequencies ?55%, except for the stratum 1. On the other hand, in A. albopictus, the allele 1534Cyskdr ranged from 3% (Marilena/PR and Porto Velho/RO) 10% (Foz do Iguaçu/PR). This is the first evidence of occurrence and distribution of kdr mutation in A. albopictus from South America. The results presented here suggest the need for an appropriate integrated use of insecticides in Colombia and Brazil, as well as the inclusion of A. albopictus monitoring to insecticides resistance in order to maintain the chemical compounds as an efficient vector control tool when necessary. Keywords: chikungunya, dengue, pyrethroid resistance, vector control, voltage-gated sodium channel, Zika

Análise da resistência a inseticidas e variabilidade genética de populações naturais de Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) (Diptera: Culicidae) da Colômbia e do Brasil

Resumo: Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) é o principal vetor do vírus dengue e febre amarela urbana nas Américas. O controle do vetor é até hoje a única opção para evitar ou reduzir a transmissão do vírus dengue. Por isso, são utilizados continuamente inseticidas químicos que ocasionam intensa pressão de seleção, acarretando problemas para os programas de controle de vetores. O monitoramento da resistência herdada por esta espécie frente aos inseticidas organofosforados e piretróides frequentemente usados, tanto na Colômbia como no Brasil, assim como o conhecimento da diversidade genética, podem servir como guia para o plano de manejo de inseticidas e controle deste vetor. Este trabalho teve como objetivo avaliar o status de suscetibilidade de larvas frente a inseticidas organofosforados, a frequência da mutação Val1016IIe relacionada à resistência a piretróides e a variabilidade genética do fragmento do gene mitocondrial ND4 em populações de A. aegypti da Colômbia e do Brasil. Foram realizados bioensaios com concentrações múltiplas e diagnósticas de temephos em três populações da Colômbia (Armenia, Calarcá, Montenegro) e oito do Brasil (Jaru, Cacoal, Guajará-Mirim e Porto Velho do Estado de Rondônia, Rondonópolis, Sinop e Várzea Grande do Estado Mato Grosso e Maringá do Estado de Paraná) para verificar a suscetibilidade ao temephos. Para avaliar a presença da mutação no códon 1016 e a diversidade genética foram amostrados em média 30 adultos de A. aegypti de cada população para a mutação kdr e 10 para a análise da variabilidade genética. Os resultados dos bioensaios a partir da dose diagnóstica 0.0162 ppm de temephos indicaram resistência nas populações de Armenia (77%) e Calarcá (62%) e alteração da suscetibilidade em Montenegro (88%). Na população avaliada de Calarcá foi detectada RR95 de 6,0, Armenia de 4,9 e Montenegro 3,7 quando comparadas com a cepa suscetível Rockefeller. No caso das populações brasileiras, das oito testadas, seis apresentaram resistência ao organofosforado (Jarú-RO, Guajará-Mirim-RO, Porto Velho-RO, Rondonópolis-MT, Sinop-MT e Várzea Grande-MT) e duas (Cacaol-RO e Maringá-PR) apenas alteração no status de suscetibilidade. Apresentando maior razão de resistência a população de Várzea Grande (14,0) e a menor na população de Maringá (3,08). Dos 107 exemplares de A. aegypti genotipadas para a mutação Val1016Ile nas quatro populações colombianas, 94% eram homozigotos para o alelo selvagem (Val/Val); 6% heterozigotos (Val/IIe) e 0% homozigotos para o alelo mutante (IIe/IIe). Para o Brasil, 251 exemplares foram genotipados. Destes, 66% (165) eram Val/Val; 11% (27) Val/IIe e 23% (59) IIe/IIe. As populações de Barcelona, na Colômbia e Maringá, no Brasil não apresentaram o alelo mutante. O estudo da diversidade genética usando ND4 mostrou uma estruturação genética entre algumas populações, tanto na Colômbia quanto no Brasil, foram detectadas três linhagens mitocondriais para cada, com baixa diversidade genética e baixo fluxo gênico. Os haplótipos obtidos para as populações da Colômbia quando comparados com os disponíveis para América indicam uma relação com as populações presentes no México e América do Norte. No caso dos haplótipos brasileiros, relação com as populações presentes no Peru, México e América do Norte. No entanto, a análises em conjunto de todos os haplótipos sugerem uma relação com as populações do Peru, México e América do Norte. As ações de controle do vetor utilizando organofosforados e piretróides podem ser comprometidas devido à perda de suscetibilidade do vetor a estes inseticidas

How much is known about the genetic diversity of the Asian tiger mosquito? A systematic review

 Introducción: Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1894) es un vector para los virus del dengue y chicunguña en la naturaleza, junto con cerca de 24 arbovirus en condiciones de laboratorio. El conocimiento de la diversidad genética de los insectos vectores es fundamental para el control eficaz y la eliminación de enfermedades transmitidas por estos.  Objetivo: Aquí se determinó el escenario actual de la diversidad genética en poblaciones naturales de A. albopictus a través de una revisión sistemática.  Metodología: Se pudieron establecer los primeros registros y distribución de las poblaciones de A. albopictus en el mundo, así como su diversidad genética, estructura genética poblacional y marcadores moleculares utilizados para determinar su diversidad genética.  Resultados: A. albopictus  se distribuye en todo el mundo con poblaciones genéticamente estructuradas y baja diversidad; Sin embargo, el 89,5% de la diversidad genética conocida se basa en el uso de RFLP, aloenzimas, isoenzimas y marcadores moleculares mitocondriales que presentan problemas significativos según la literatura. Una vez obtenidos los resultados, se realizó un análisis crítico y se detectaron deficiencias existentes. Conclusión:  El conocimiento actual de la diversidad genética de A. albopictus se basa en arcadores genéticos que presentan problemas significativos  reportados en la literatura; Por lo tanto, los programas de control de vectores dirigidos a las poblaciones de A. albopictus  pueden verse comprometidos Palabras clave: Aedes albopictus, Marcadores moleculares, Flujo genético Introduction: Aedes (Stegomyia) albopictus (Skuse, 1894) is a vector for dengue and chikungunya viruses in the field, along with around 24 additional arboviruses under laboratory conditions. Knowledge of the genetic diversity of insect vectors is critical for the effective control and elimination of vector-borne diseases.  Objective: We determined the current scenario of the genetic diversity in natural populations of A. albopictus through a systematic review.  Methodology: It was possible to establish the first reports and distribution of A. albopictus populations in the world, as well as its genetic diversity, population genetic structure and molecular markers used to determine its genetic diversity.  Results: A. albopictus is distributed worldwide with genetically structured populations and low diversity; however, 89.5% of the genetic diversity known is based on the use of RFLP, allozymes, isozymes, and mtDNA molecular markers that exhibit significant problems according to the literature. After the results were obtained, a critical analysis was carried out and existing shortcomings were detected.  Conclusion: The current knowledge of genetic diversity of A. albopictus is based on genetic markers that exhibit significant problems reported in the literature; therefore, vector control programs targeting A. albopictus populations, may be compromised Keywords: Aedes albopictus, Genetic Markers, Gene Flow

Control del vector del dengue utilizando fracciones etéreas de dos plantas (asteraceae) como larvicidas

Objetivo Evaluar la actividad larvicida de dos fracciones etéreas de Heli opsisoppositifolia (L.) Drucey Jaegeria hirta (Lag.) Less en larvas de Aedes (Stegomyia) aegypti (L.) de 3-4 ínstar, en el municipio de Armenia, Quindio.Métodos Se realizó la colecta y análisis fitoquímico preliminar de dos especies vegetales, H. oppositifolia y J. hirta. Fueron preparadas fracciones etéreas de las dos especies. Con estas fracciones, fueron evaluadas 11 concentraciones para determinar las concentraciones letales CL50, CL90 y CL95 después de 24 y 48h. Con los resultados de las CL50,CL90 y CL95, se simuló y construyó un modelo que describe la dinámica población-concentración letal.Resultados La marcha fitoquímica preliminar permitió caracterizar en H. oppositifoliay J. hirta la presencia de: Taninos, flavonoides, quinonas, glicósidos cardiotónicos, esteroles, lactonas, terpenos, coumarinas y alcaloides. Las CL, 48 después para J. hirta (CL5024 CL9070 y CL9593 ppm) fueron menores que H. oppositifolia (CL5039, CL9077y CL9594 ppm). El ANOVA factorial confirmó esta tendencia, J. hirta (66 %, F=18.5, p and lt;0.05) y H. oppositifolia (34 %, F=18.5, p and lt;0.05). La simulación matemática sugiere que la aplicación cada 15 días de la CL50, y cada 30 días de las CL90 y CL95 de cualquiera de las dos especies, tienen la misma respuesta que la utilización de las CL90 y CL95 cada 30 días o la CL50 cada 15 días.Conclusión Ambas especies poseen efecto larvicida. Sin embargo, J. hirta se mostró más promisoria como futuro bioinsecticida para el control de estados inmaduros de Ae. aegypti

Control of Aedes (Stegomyia) aegypti using Bacillus thuringiensis var. israelensis in Armenia, Quindío, Colombia

In Colombia, Aedes aegypti is resistant to most used insecticides. Due to the slow development of resistance to Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti) as well as its high specificity and environmental safety, the use of this larvicide becomes an alternative in the management of this vector. In this work, we evaluated experimentally and describe by a mathematical model the dyamics of control of natural populations of A. aegypti using Bti. The susceptibility profile to Bti was determined through dose-response bioassays with larvae collected in Armenia (Quindío, Colombia). In addition, in order to estimate the susceptibility profile, an analysis was carried out using the mortality data obtained from the four localities analyzed. The mortality data were used to estimate the lethal concentrations (LC50 and 95) from each locality. Using these LC, hypothetical simulations of vector behavior were carried out, obtained from a mathematical model that describes the population dynamics, using successive applications of Bti at different time intervals. The dose-response bioassays indicate tha the analyzed vector populations are susceptible to Bti since they present a biological response similar to the one obtained from A. aegypti Rockefeller strain. Computer simulations using sustained periodic inspection indicate Bti is effective for the vector control. Nevertheless, its long-term efficiency depends on relation between the LC and the frequency of application. It is concluded that the sustained application of Bti represents a long-term viable alternative for the control of A. aegypti populationsEn Colombia, Aedes aegypti es resistente a la mayoría de insecticidas utilizados. Debido al lento desarrollo de resistencia a Bacillus thuringiensis var. israelensis (Bti), así como su alta especifi cidad e inocuidad ambiental, el uso de este larvicida, se torna una alternativa en el manejo de este vector. En este trabajo, se evaluó experimentalmente y describió por medio de un modelo matemático, la dinámica del control de poblaciones naturales de A. aegypti, utilizando Bt i. Se determinó el perfi l de susceptibilidad, a través de bioensayos dosis-respuesta con larvas colectadas de Armenia (Quindío, Colombia). Adicionalmente, con los datos de mortalidad de las localidades analizadas, un nuevo análisis fue realizado, para estimar el perfi l de susceptibilidad del municipio de Armenia. Los datos de mortalidad fueron utilizados para calcular las concentraciones letales 50 y 95. Con éstas, se realizaron simulaciones hipotéticas del comportamiento del vector, obtenidas a partir de un modelo matemático, que describe la dinámica poblacional, usando aplicaciones sucesivas de Bti y diferentes intervalos de tiempo. Los bioensayos dosis-respuesta indican que las poblaciones del vector analizadas son susceptibles al Bti, por presentar una respuesta biológica similar a la obtenida en la cepa de referencia Rockefeller. Las simulaciones aplicando un control periódico sostenido, sugieren que el Bti es efectivo para controlar el vector; sin embargo, su efi ciencia a largo plazo depende de la relación entre concentración letal y frecuencia de aplicación. Se concluye que la aplicación sostenida de Bti constituye una alternativa viable para el control de poblaciones de A. aegypti, a largo plazo.Incluye referencias bibliográfica

Determinación de los efectos alelópaticos de extractos etanólico y acuoso de hojas, tallos y raices de juglans neutropica diels sobre semillas de lactuca sativa l.

Se realizo un estudio para determinar los efectos alelopáticos de extractos etanólico y acuoso de hojas, tallos y raíces de juglans neotropicaPregradoBiólog

First report of the Phe1534Cys kdr mutation in natural populations of Aedes albopictus from Brazil

Submitted by Sandra Infurna ([email protected]) on 2017-10-10T13:59:23Z No. of bitstreams: 1 ademirmartins_etal_IOC_2017.pdf: 1128662 bytes, checksum: eb70aaea987ca31181ed827c655c15f7 (MD5)Approved for entry into archive by Sandra Infurna ([email protected]) on 2017-10-10T14:11:47Z (GMT) No. of bitstreams: 1 ademirmartins_etal_IOC_2017.pdf: 1128662 bytes, checksum: eb70aaea987ca31181ed827c655c15f7 (MD5)Made available in DSpace on 2017-10-10T14:11:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ademirmartins_etal_IOC_2017.pdf: 1128662 bytes, checksum: eb70aaea987ca31181ed827c655c15f7 (MD5) Previous issue date: 2017Universidade Federal do Paraná. Departamento de Zoologia. Setor de Ciências Biológicas. Laboratório de Entomologia Médica e Veterinária. Curitiba, Paraná, Brasil.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Fisiologia e Controle de Artrópodes Vetores. Rio de Janeiro, RJ. Brasil / Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em Entomologia Molecular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Zoologia. Setor de Ciências Biológicas. Laboratório de Entomologia Médica e Veterinária. Curitiba, Paraná, Brasil.Knockdown resistance (kdr), caused by alterations in the voltage-gated sodium channel (NaV), is one of the mechanisms responsible for pyrethroid (PY) resistance. In the Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, at least four different mutations were described in the IIIS6 NaV segment in populations from Asia, North America and Europe. In contrast, in Aedes aegypti at least 12 non-synonymous mutations have been reported at nine different codons, mostly in the IIS6 and IIIS6 NaV segments. The Phe1534Cys kdr mutation in the IIIS6 NaV segment is the most prevalent in populations of Ae. aegypti worldwide, also found in Ae. albopictus from Singapore. Herein, we investigated the DNA diversity corresponding to the IIS6 and IIIS6 NaV segments in natural populations of Ae. albopictus from Brazil

Potential geographic distribution of the tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse, 1894) (Diptera: Culicidae) in current and future conditions for Colombia.

In Colombia, little is known on the distribution of the Asian mosquito Aedes albopictus, main vector of dengue, chikungunya, and Zika in Asia and Oceania. Therefore, this work sought to estimate its current and future potential geographic distribution under the Representative Concentration Paths (RCP) 2.6 and 8.5 emission scenarios by 2050 and 2070, using ecological niche models. For this, predictions were made in MaxEnt, employing occurrences of A. albopictus from their native area and South America and bioclimatic variables of these places. We found that, from their invasion of Colombia to the most recent years, A. albopictus is present in 47% of the country, in peri-urban (20%), rural (23%), and urban (57%) areas between 0 and 1800 m, with Antioquia and Valle del Cauca being the departments with most of the records. Our ecological niche modelling for the currently suggests that A. albopictus is distributed in 96% of the Colombian continental surface up to 3000 m (p < 0.001) putting at risk at least 48 million of people that could be infected by the arboviruses that this species transmits. Additionally, by 2050 and 2070, under RCP 2.6 scenario, its distribution could cover to nearly 90% of continental extension up to 3100 m (≈55 million of people at risk), while under RCP 8.5 scenario, it could decrease below 60% of continental extension, but expand upward to 3200 m (< 38 million of people at risk). These results suggest that, currently in Colombia, A. albopictus is found throughout the country and climate change could diminish eventually its area of distribution, but increase its altitudinal range. In Colombia, surveillance and vector control programs must focus their attention on this vector to avoid complications in the national public health setting

Effect of altitude on wing metric variation of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in a region of the Colombian Central Andes.

In mosquitoes of medical importance, wing shape and size can vary with altitude, an aspect that can influence dispersion and, consequently, their vector capacity. Using geometric morphometry analysis, Aedes aegypti wing size and shape variation of males and females was studied in four altitudes in the second-smallest department in Colombia: 1,200 m (Tebaida), 1,400 m (Armenia), 1,500 m (Calarcá), and 1,700 m (Filandia). Wing shape in males (P < 0.001) and females (P < 0.001) was significantly different through the altitudinal gradient; in turn, wing size in males followed the altitudinal gradient males (R2 = 0.04946, P = 0.0002), females (R2 = 0.0011, P = 0.46). Wing allometry for males (P < 0.001) and females (P < 0.001) was significant. Likewise, the shape and size of the wings of males (P < 0.001) and females (P < 0.001) had significant fluctuating asymmetry. It is concluded that, in a small scale with an altitudinal variation of 500 meters, it is detected that the size and shape of the wings varied in A. aegypti, main vector the agents that cause dengue, chikungunya, and Zika. The fluctuating asymmetry is present in the individuals studied and could be associated with environmental effects caused by vector control campaigns present in some sampling locations