装载RNA“病毒样”纳米颗粒表面巯基化表达载体的构建及荧光修饰

以本实验室构建的能够装载外源RNA片段的MS2噬菌体“病毒样”颗粒表达载体为基础,利用定点突变技术将衣壳蛋白基因的第15位密码子由编码苏氨酸突变为胱氨酸。表达产物在35%蔗糖密度梯度处有一目的产物,目的产物在透射电镜下呈球形,直径大小约为27nm。用马来酰亚胺5′荧光素对表达产物进行化学修饰,经光谱分析、SDSPAGE分析和MALDITOFMS鉴定,证明巯基在表达产物的外表面,并能与马来酰亚胺5′荧光素进行反应。这种携带外源RNA片段的荧光修饰的天然纳米颗粒为制备各种功能性纳米材料提供了新途径

ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

以原癌基因Kras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBRGreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明:在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBRGreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一

双链置换探针实时PCR用于DNA池的等位基因频率测定

结合荧光双链置换探针的特异性和实时PCR的准确定量能力,建立了一种新颖、准确、价廉且高通量的测定DNA池等位基因频率的方法.该方法采用不同荧光标记的双链置换探针1次PCR反应即可测定出等位基因频率.实验以β 地中海贫血CDs41 42( TCTT)突变为对象,分别用荧光染料FAM和ROX标记野生型和突变型探针,由实时PCR检测建立的等位基因浓度与循环阈值的响应曲线计算DNA池的等位基因频率.结果表明,建立的系列等位基因浓度与循环阈值呈线性关系,线性相关系数分别为0.9977(野生型等位基因)和0.9938(突变型等位基因),可检测的最低等位基因频率达1%,等位基因频率在1%～90%范围内测定误差小于4%.该方法可广泛用于流行病学调查、遗传连锁分析以及全基因组连锁不平衡扫描等领域

“突触引物”实时荧光PCR检测端粒酶活性

为建立一种简便的端粒酶测定方法 ,首先采用高灵敏的核酸染料SYBRGold染色代替放射自显影 ,建立了简便可靠的扩增产物显示方法 .进而合成了端粒酶扩增产物的模拟产物 ,考察了突触引物检测的可行性和灵敏度 .在此基础上 ,建立了检测端粒酶活性实时荧光PCR .由于突触引物可以有效的降低非特异扩增 ,有效解决了端粒酶活性检测中的非特异产物干扰 ,为定量检测端粒酶活性打下了基

用荧光双链引物特异扩增并定量核酸

描述了一种利用特殊的双链引物———突触引物 ,用于核酸扩增的特异定量检测 .在传统的引物的 5’端标记荧光物质 ,而在引物的互补序列的 3’端标记荧光淬灭剂以封闭其延伸 .二者杂交即成双链突触引物 .在制备PCR反应混合物阶段以及加热的初期 ,突触引物保持稳定的双链结构而不能引导扩增 ,在退火阶段 ,突触引物部分解链导致引物延伸 ,荧光物质与淬灭剂分开而产生荧光 .利用人 β珠蛋白基因对此方法进行了验证 .这种可自行退火的荧光引物不仅简单地实现了实时扩增 ,同时比常规的热启动PCR更有效地提高了扩增的特异

实时检测限制性内切酶活性的发夹型荧光探针

基于分子信标的原理 ,设计了一种发夹型荧光探针作为限制性内切酶作用的专一底物 ,来研究限制性内切酶的剪切作用。检测BglII和NcoI表明 ,这种探针不仅可以灵敏、实时地指示内切酶的活性 ,采用不同荧光标记的探针还可以同时特异地显示双酶切反应中两个酶各自的活性。并且以Rotor Gene 2 0 0 0实时荧光PCR仪作仪器检测 ,实现了高通量的操作。利用其特有的作变温曲线的功能 ,能很好的区分限制性内切酶与发夹型荧光探针的特异剪切与非特异的结

双链探针同步荧光技术快速筛查C282Y点突变

以荧光染料Fam和Joe分别标记野生型和突变型双链探针作为均相检测探针,以构建的DNA模板作为研究模型,采用固定波长差同步荧光分析法对PCR反应产物进行终点检测。通过对HFE基因C282Y点突变的检测,并以限制性内切核酸酶RsaI证实,该方法是一种廉价、快速、可靠的筛查遗传性血色病基因C282Y突变的方法,该法可扩展到各种基因的突变检测

用细胞电泳技术检测化疗药物电性

细胞电泳技术可用于研究氟尿嘧啶(5FU),甲氨喋呤(MTX)和环磷酸胺(CP)等药物的电性,用戊二醛化绵羊红细胞(SRBC)为载体,分别吸附3种化疗药物,均可以导致细胞表面电荷下降致使电泳缓慢率为:5 FU 14.55％,MTX 13.77％,CP 12.21％,这3种药物均带正电荷,此研究对电化学疗法结合化疗治疗恶性肿瘤有参考价值

一种快速判断癌疗药物电性的方法

在诸多的癌症疗法中,电化学疗法由于可以结合局部用药,显示出很大的优越性。最近提出的一种新的电化学疗法,即是在通电的同时,加入化疗药物,应用此法,须知药物在生理环境中的电性,即在pH7.4的水溶液中,药物的正负电性。目前,药物电性判断尚无通用的方法,电泳技术虽然可行,但需专门的仪器,操作较复杂,且易受温度、介质、浓度pH值等因素的