以原癌基因Kras基因12位密码子的4种基因型(野生型为GGT,突变型为AGT、TGT、CGT)质粒DNA为研究模型,采用SYBRGreenⅠ为实时PCR指示剂,进行ARMS实时PCR基因分型特异性的研究.结果表明:在和模板匹配的ARMS引物3′端附近引入故意错配碱基,将ARMS引物浓度稀释10倍,并对传统三步PCR循环进行改良,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异,在传统延伸步骤之后增加一步恒温80℃检测荧光步骤,可消除引物二聚体的影响,使ARMS引物的特异性增强,得到清晰的基因分型结果.实验表明这种基于SYBRGreenⅠ的ARMS实时PCR基因分型方法,无需合成探针,实验设计简单,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法,可推广用于其他基因的分型,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一

李庆阁

梁基选

郑薇薇

Xiamen University Institutional Repository

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net第 44 卷 　增 刊 厦门大学学报 (自然科学版) Vol. 44 　Sup .　2005 年 6 月 Journal of Xiamen University (Nat ural Science) J un. 2005 　A RMS 实时 PCR 基因分型特异性的研究　　收稿日期 :2005202228基金项目 :国家自然科学基金 (30170834) 和福建省自然科学基金重点项目 (C0220002)资助作者简介 :郑薇薇 (1980 - ) ,女 ,硕士研究生.3 通讯作者 :0592 - 2187363 ,qgli @xmu. edu. cn郑薇薇1 ,梁基选2 ,李庆阁1 3(1. 厦门大学生命科学学院 生物医学系 ,细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室 ,2. 厦门大学医学院 抗癌研究中心 ,福建 厦门 361005)摘要 : 以原癌基因 K2ras 基因 12 位密码子的 4 种基因型 (野生型为 GGT ,突变型为 A GT、T GT、CGT) 质粒 DNA 为研究模型 ,采用 SYBR Green Ⅰ为实时 PCR 指示剂 ,进行 ARMS 实时 PCR 基因分型特异性的研究. 结果表明 :在和模板匹配的ARMS 引物 3′端附近引入故意错配碱基 ,将 ARMS 引物浓度稀释 10 倍 ,并对传统三步 PCR 循环进行改良 ,即根据目的产物和引物二聚体的熔点差异 ,在传统延伸步骤之后增加一步恒温 80 ℃检测荧光步骤 ,可消除引物二聚体的影响 ,使 ARMS引物的特异性增强 ,得到清晰的基因分型结果. 实验表明这种基于 SYBR Green Ⅰ的 ARMS 实时 PCR 基因分型方法 ,无需合成探针 ,实验设计简单 ,是一种快速、简便、经济、特异性好的基因分型方法 ,可推广用于其他基因的分型 ,并可望成为应用于临床的基因诊断技术之一.关键词 : 实时 PCR ;ARMS ;基因分型中图分类号 : Q 52 　　　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 :043820479 (2005) Sup20135205　　人类基因组计划的完成 ,加速了疾病相关基因的结构和功能研究 ,其中对 SN P ( Single Nucleotide Pol2ymorp hism ,单核苷酸多态性) [1 ] 、致病基因[ 2 ,3 ] 、病原体亚型以及耐药基因等[4 ]的基因分型研究具有重要意义. 目前主要的基因分型方法有 PCR2RFL P ( Rest rict2ed Fragment Length Polymorp hism ,限制性片断长度多态性 ) , PCR2SSCP ( Single St rand ConformationPolymorp hism ,单链构象多态性) , HA ( HeteroduplexAnalysis ,异源双链分析) ,以及 DNA 测序等 ;但以上这些方法普遍存在操作繁琐 ,检测时间过长等缺点. 近年来 ,出现了许多高通量的分型技术 ,如变性高效液相色谱 (D H PL C) [5 ] ,生物质谱[ 6 ] ,基因芯片等 ;然而这些方法都涉及后 PCR 操作 ,而且仪器昂贵 ,限制了其临床应用. 本研究以 K2ras 基因 12 位密码子的 4 种基因型 (野生型为 GGT ,突变型为 A GT、T GT、CGT) 为研究模型 ,采用 SYBR Green Ⅰ为实时 PCR 指示剂 ,主要从 ARMS 引物的设计 ,引物浓度的选择 , PCR 反应体系及条件的优化 (对传统 PCR 三步法进行改良) 等方面进行 A RMS 实时 PCR 基因分型的特异性研究 ,希望在此基础上发展一种快速、简便、经济、准确的适合临床应用的基因分型方法.1 　材料与方法1 . 1 　材 　料DNA 模板 : K2ras 基因野生型质粒 DNA 模板 (12位密码子为 GGT ,简称 GGT 模板 ,以下同) 直接以正常人基因组 DNA 为模板构建 ,12 位密码子突变型质粒 (分别为 A GT、T GT、CGT) 采用引物重叠延伸法构建. 所有构建的质粒 DNA 模板序列均经测序确认.主要仪器和试剂 : Rotor Gene 3000 实时荧光PCR 仪 (Corbet t Research ,Aust ralia) . Taq 酶、dN TP等购自大连宝生物工程有限公司 ,SYBR Green Ⅰ购自厦门百维信生物有限公司.引物 :根据已公布的 K2ras 基因的 1 号外显子的序列设计特异的 A RMS 上游引物和一条公共的下游引物 (序列如表 1 所示) ,所有引物由上海生工生物工程有限公司合成.1 . 2 　方 　法1. 2. 1 PCR 扩增产物和引物二聚体熔解曲线分析PCR 体系总体积 200μL ,含 20μL10 ×buffer ,50mmol/ L MgCl2 ,0. 2 mmol/ L dN TPs ,10U Taq 酶 ,2. 0μL SYBR Green Ⅰ(1 :10 000 稀释) ,0. 4μmol/ L 下游引物 (表 1 中 P6) . 将上述组分混匀后 ,分装两大管 ,每管体积 100μL ,分别加入表 1 中的 P1、P2 引物各0. 4μmol/ L . 然后每大管再分装 5 小管 ,每小管最终体积25 μL , 使每条引物分别对 4 种质粒 DNA 模板(约0 . 5 ng) 和水 (作为阴性对照 ) 进行 PCR扩增与© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net表 1 　ARMS 引物列表Tab. 1 　ARMS primers名称 编号 核苷酸序列A GT 　　　 P1 5′2ACTT GT GGTA GTT GGA GCTA23′A GT( n - 3) P2 5′2ACTT GT GGTA GTT GGACCTA23′T GT( n - 3) P3 5′2ACTT GT GGTA GTT GGACCTT23′CGT( n - 3) P4 5′2ACTT GT GGTA GTT GGACCTC23′GGT( n - 3) P5 5′2ACTT GT GGTA GTT GGACCT G23′Antisense 　 P6 5′2GT T GGA TCA TA TTCGTCCAC23′　　注 :下划线表示故意引入的错配碱基 ; P1～ P2 :用于扩增A GT 模板的 ARMS 上游引物 ; P3～P5 为分别扩增 T GT、CGT、GGT 模板的 ARMS 上游引物 ; P6 为公共的下游引物.结果分析. 反应条件 :94 ℃预变性 2 min ;94 ℃变性 15s ,55 ℃退火 20 s ,72 ℃延伸 20 s ,扩增 40 个循环 ;在每一循环的退火温度时收集荧光信号. PCR 反应后 ,按0. 5 ℃/ step 的升温速率从 65 ℃递增至 99 ℃进行熔解曲线分析.1. 2. 2 ARMS 实时 PCR 反应体系及条件优化A RMS 引物筛选及 PCR 反应步骤改良 : PCR 体系组成同 1. 2. 1. 反应条件 :94 ℃预变性 2 min ;94 ℃变性 15 s ,55 ℃退火 20 s ,72 ℃延伸 20 s ,80 ℃恒温 5 s ,扩增 40 个循环 ;在每一循环的 80 ℃时收集荧光信号.A RMS 引物浓度的优化 :将 P2 引物 (0. 4μmol/L)分别稀释 10 倍、20 倍后 ,再进行实时荧光 PCR 分型. 反应体系其他成分及反应条件同上.1. 2. 3 ARMS 实时 PCR 基因分型PCR 体系总体积 400μL ,含 40μL10 ×buffer ,50mmol/ L MgCl2 ,0. 2 mmol/ L dN TPs ,20U Taq 酶 ,4. 0μL SYBR Green Ⅰ(1 :10 000 稀释) ,0. 4μmol/ L 下游引物 (表 1 中 P6) . 将上述组分混匀后 ,分装 4 大管 ,每管体积 100μL ,分别加入表 1 中的 P2、P3、P4、P5 引物各 0. 04μmol/ L . 然后每大管再分装 5 小管 ,每小管最终体积 25μL ,使每条引物分别对 4 种质粒 DNA 模板(约 0. 5 ng)和水 (作为阴性对照) 进行 PCR 扩增与结果分析. 反应条件 :94 ℃预变性 2 min ;94 ℃变性 15 s ,55 ℃退火 20 s ,72 ℃延伸 20 s ,80 ℃恒温 5 s ,扩增 40个循环 ;在每一循环的 80 ℃时收集荧光信号.2 　结　果2 . 1 　PCR 扩增产物和引物二聚体熔解曲线分析在进行 PCR 扩增后 ,对产物进行熔解曲线分析 ,结果如图1所示 ,引物 P1和 P2的熔点大约在7 7～　图 1 　PCR 扩增产物及引物二聚体的熔解曲线分析黑色虚线 : P1 引物二聚体 ;黑色实线 : P1 引物对A GT 模板扩增产物 ;灰色虚线 : P2 引物二聚体 ;灰色实线 : P2 引物对 A GT 模板扩增产物　Fig. 1 　Melting curve analysis of PCR product s and prim2er2dimers78 ℃左右 ,而 A GT 模板扩增目的产物的熔点在 83 ℃.根据两者熔点的差别 ,对传统三步法 PCR 进行改良 ,即在传统延伸步骤之后再增加一步恒温 80 ℃采集荧光信号 ,可以消除引物二聚体对基因分型的影响 ,可望增加 A RMS 引物基因分型的特异性.2 . 2 　ARMS 实时 PCR 反应体系优化结果A RMS 引物筛选及 PCR 循环改良结果 :用于扩增 A GT 模板的两条 ARMS 引物 P1 和 P2 ,其中 P1 是和模板序列完全互补的引物 ,而 P2 是在距离 3′端的第 ( n - 3)位点引入故意的错配 G以 C 取代的引物. 传统三步法 PCR 基因分型结果如图 2 (A) 和 2 (B) 所示 ,虽然目的产物 A GT 模板的荧光信号都是最先升起来的 ,但是采用 P1 引物时 , GGT 模板的错配延伸明显 ,而采用 P2 引物时 ,引物二聚体影响很大 ,均对 A GT模板的分型造成困难. 对 PCR 循环进行改良后 ,即在传统延伸步骤之后再增加一步恒温 80 ℃采集荧光信号 ,结果如图 2 (C)和图 2 (D) 所示 ,引物二聚体对基因分型的影响基本消除 ,尤其是采用 P2 引物和改良四步法 PCR 结合后 ,目的产物 A GT 模板和其他的产物的荧光信号可以很清晰的区分 ,基因分型特异性大大增加.A RMS 引物浓度优化结果 :将引物浓度稀释 10、20 倍后的结果表明 ,若稀释倍数太低 (图 3A 所示) ,对基因分型的结果改善不明显 ;若稀释倍数太高 (图 3C所示) ,则造成目的产物扩增效率太低 ,不利于基因分型 ,总的来说本研究中所采用的 P2 引物稀释 10 倍时可得到特异性较好的分型结果 (图 3B 所示) .·631· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2005 年© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　图 2 　ARMS 实时 PCR 基因分型引物筛选及 PCR 循环改良A、B 图分别采用 P1、P2 引物和传统三步法 PCR(55 ℃采集荧光信号)进行 ARMS 实时 PCR 基因分型 ;C、D 图分别采用 P1、P2 引物和改良四步法 PCR (80 ℃采集荧光信号) 进行 ARMS 实时 PCR 基因分型 ; □2□:A GT 模板 ,■2■ T GT 模板 , &2 & CGT 模板 , ▲2▲ GGT 模板 ,222222 引物二聚体　Fig. 2 　Selection of primers and optimization of PCR cycles for ARMS real2time PCR genotyping　图 3 　ARMS 实时 PCR 基因分型引物浓度优化A、B、C 图分别采用 0. 4μmol/ L 、0. 04μmol/ L 、0. 02μmol/ L 的 P2 引物进行 ARMS 实时 PCR 基因分型 ; □2□:A GT 模板 , ■2■ T GT 模板 , &2 & CGT 模板 , ▲2▲ GGT 模板 ,222222 引物二聚体　Fig. 3 　Optimization of the concentration of ARMS primers2 . 3 　ARMS 实时 PCR 基因分型经过上述对 ARMS 实时 PCR 基因分型特异性的探讨后 ,采用在距离 3′端的第 ( n - 3) 位点引入故意错配碱基的 A RMS 引物 ,并将该引物浓度稀释 10 倍(0. 04μmol/ L) ,结合改良的四步法 PCR 进行基因分型研究. 结果如图 3 所示 ,4 种基因型均可以得到很好的区分 ,错配模板和引物二聚体的影响都降到最低 ,基本不影响基因分型结果的判定.3 　讨　论扩增受阻突变体系 ( Amplification Ref ractoryMutation System ,A RMS) 也称作等位基因特异性扩增法 (Allele2specific amplification ,ASA) 或等位基因特异性 PCR (Allele2specific PCR ,ASPCR) ,其基本的原理[7 ]都是 3’端错配原则 (3′2mismatch principle) :在进行扩增反应时 ,若 3′端碱基对形成错配 ,链延伸反应就会因 3′,5′2磷酸二酯键形成的障碍而受阻 ,因此 ,只·731·增刊 　　　　　　　　　　 　　　　郑薇薇等 :ARMS 实时 PCR 基因分型特异性的研究© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net　图 4 　ARMS 实时 PCR 基因分型A、B、C、D 图分别采用 P2、P3、P4、P5 引物进行 ARMS 实时 PCR 基因分型 ; □2□:A GT 模板 , ■2■ T GT 模板 , &2& CGT 模板 , ▲2▲ GGT 模板 ,222222 引物二聚体　Fig. 4 　ARMS real2time PCR genotyping有模板链是特定的等位基因时 ,才会检测出特异的扩增产物. 一直以来将 PCR 和 A RMS 方法结合 ,扩增后采用电泳方法检测仍是分型的主要手段 ,但很显然 ,繁琐的实验操作和 PCR 产物污染等问题限制了该方法的应用. 实时荧光 PCR 的出现 ,给人们带来实现实时检测的希望. 近来有报道 :在 ARMS 的反应体系中 ,引物上标记 2 个不同荧光素 ,通过对产物荧光分析进行基因分型 ,此法称为双荧光扩增受阻突变系统 (doublefluorescent2amplification ref ractory mutation system ,dF2A RMS) [8 ] ;还有在 ARMS 的反应体系中 ,加入一个 ResonSense 探针[4 ]进行实时基因分型 ;以及采用各种其他类型荧光探针[9 ] 等方法都是以实时荧光 PCR为基础的基因分型方法. 但无论是标记荧光素还是采用荧光探针 ,在一定程度上增加了实验设计的难度和实验成本 ,也就限制了其临床的应用. 本研究采用序列特异的 A RMS 引物进行扩增 ,以 SYBR Green Ⅰ荧光染料为实时 PCR 指示剂 ,并在传统三步法 PCR 的基础上 ,根据产物和引物二聚体之间熔点的差异 ,增加一步 80 ℃恒温 5 s 进行荧光采集 ,实际上并没有抑制引物二聚体的生成 ,而是在检测时将其信号掩盖 ,消除引物二聚体的影响. 其原理与报道的 ARMS 引物结合ResonSense[4 ]探针进行实时 PCR 基因分型相同 ,所以一定程度上可取代探针.A RMS 实时 PCR 基因分型特异性的另一关键就是 ARMS 引物本身的特异性. 在所有的碱基对中G: T错配相对容易[10 ] ,如图 2 ( A) 所示 , A GT 模板 (匹配型)和 GGT 模板 (错配型) 扩增的 Ct 值只相差 7～8 ,难以区分基因型. 为增加引物的特异性 , 设计在ARMS 引物 3′端 ( n - 3)位引入一个故意的错配碱基 ,但该错配碱基的引入使得形成大量引物二聚体 ,图 2(B) 所示. 对传统 PCR 循环进行改良后 , 可增加ARMS 引物的特异性 ,消除引物二聚体的影响 ,增加其分型的能力 ,如图 2 (D) 所示. 此外 ,ARMS 引物的特异性与反应体系密切相关 ,因此 ,对反应体系进行优化是十分必要的. 除了常规的 Mg2 + 浓度和退火温度的优化外 ,本研究对引物浓度对分型特异性的影响进行考察 ,结果表明 : 对引物浓度进行稀释可以增加ARMS 引物的特异性 ,但是与此同时产物的扩增效率会降低. 如图 3 所示 ,未稀释引物扩增 Ct 值为 10 ,将引物稀释 10 倍后 Ct 值为 20 ,稀释 20 倍后 Ct 值为 30.所以必须找到一个平衡点 ,选择最佳的反应条件可以取得令人满意的分型效果 ,如图 4 所示 ,在本实验进行优化后的 PCR 反应条件下 , K2ras 基因的 4 种基因型得到了很好的区分.本研究对基于 SYBR Green Ⅰ的 A RMS 实时PCR 基因分型方法的特异性进行探讨 ,结果表明 ,经·831· 厦门大学学报 (自然科学版) 　　　　　　　　　 　　　　　　　　　2005 年© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.    http://www.cnki.net优化后的这种基于 SYBR Green Ⅰ结合改良四步法PCR 的 ARMS 实时 PCR 基因分型方法 ,无需合成探针、设计简单 ,是一种快速、简便、经济、准确的基因分型方法 ,可推广用于其他基因的分型 ,并可望成为可用于临床的基因诊断技术之一.参考文献 :[1 ] 　Brightwell G ,Wycherley R ,Waghorn A. SN P genotypingusing a simple and rapid single2tube modifcation of ARMSillust rated by analysis of 6 SN Ps in a population of maleswith FRAXA repeat expansi2 ons[J ] . Molecular and Cel2lular Probes ,2002 ,16 :297 - 305.[2 ] 　Simon J C , Frank M S ,Jill W ,et al. Comparison of twoapproaches to somatic mutation detection using ARMS al2lele2specific amplification [ J ] . Clinical Chemist ry , 2000 ,46 :1 929 - 1 938.[3 ] 　Donatella M ,Maria T P , Pat rizia C ,et al. Identification ofG6PD Mediterranean mutation by amplification ref ractorymutation system[J ] . Clinica Chimica Acta. ,2002 ,321 :43- 47.[4 ] 　Parvinder P , Pat ricia C ,Chong2Gee T ,et al. Quantitationof hepatitis B lamivudine resistant mutants by real2 timeamplification ref ractory mutation system PCR[J ] . 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The result s showedthat using ARMS primers harboring additional mismatch at ( n - 3) position could further greatly increase the specificity of the geno2typing. ARMS real2time PCR genotyping proved to be a rapid ,simple ,cost effective ,and reliable genotyping method. It could be appli2cable to genotyping of a variety of genes and had the potential to apply in clinical diagnosis.Key words : real2time PCR ;ARMS ;genotype·931·增刊 　　　　　　　　　　 　　　　郑薇薇等 :ARMS 实时 PCR 基因分型特异性的研究

ARMS实时PCR基因分型特异性的研究

http://dspace.xmu.edu.cn/bitstream/handle/2288/18076/ARMS%e5%ae%9e%e6%97%b6PCR%e5%9f%ba%e5%9b%a0%e5%88%86%e5%9e%8b%e7%89%b9%e5%bc%82%e6%80%a7%e7%9a%84%e7%a0%94%e7%a9%b6.pdf?sequence=1&isAllowed=y

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