アフリカツメガエル卵母細胞を用いるタンパク質生合成のための簡易微量注入法(農芸化学部門)

アフリカツメガエル卵母細胞へのRNA, DNA等の細胞成分注入用の簡易な微量注入装置を考案, 試作した。この装置を用い特に植物性mRNAをアフリカツメガエル卵母細胞へ注入しタンパク質生合成を行わせた。その結果, tobacco mosaic virus RNA, brome mosaic virus RNA, イネglutelin前駆体mRNA, エンドウriburose 1,5 bis-phosphate carboxylase mRNAが忠実に翻訳され, 対応するpolypeptideが形成されることをsodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel電気泳動(SDS-PAGE)による分子量の測定と免疫学的方法を組合わせることにより確認した。A simplified and convenient microinjection system to inject cell components such as DNA and RNA into Xenopus oocytes was devised and constructed. By use of this system, RNAs of plants were injected into Xenopus oocytes, then their protein syntheses were examined. Tobacco mosaic virus RNA, brome mosaic virus RNA, rice glutelin precusor mRNA, and pea Riburose 1,5bisphosphate carboxylase mRNA were faithfully translated. The nature of the synthesized polypeptide was confirmed by fluorography using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoelctrophoresis

PCR (Polymerase Chain Reaction) を用いたイネ種子一粒の組織からの cDNA library 構築(農芸化学部門)

通常,植物のcDNAライブラリー構築には数十∿数百グラムの材料を必要とし,器官レベルまでの構築が限界であった。本研究では,PCR法を用いイネ種子一粒を出発材料にして組織,細胞レベルのcDNAライブラリー構築を目指した。その結果,登熟イネ種子の三分の一粒相当から得たアリューロン層,デンプン性胚乳に対応するcDNAライブラリーを構築することが出来た。胚乳ライブラリーからは1.3kbpのグルテリンcDNAクローン,0.6kbpの全長プロラミンcDNAクローンの存在を確認した。同様に,アリューロン層cDNAライブラリーからは数種のアリューロン層特異的クローンを得ることができた。これらのことより,この方法を用い組織,細胞レベルでの遺伝子発現機構が厳密に調査可能であることが判った。We constructed a cDNA library from a single developing rice grain. RNA was obtained from a sheet of manually peeled aleurone layer from one third of a single rice grain. Single stranded cNDAs were amplified using the PCR technique after oligo (dG) tails were introduced on the 3\u27-ends of the single stranded cDNAs obtained directly from the mRNAs. The resulting cDNAs were ligated into Bluescript SK+to obtain a cDNA library consisting of about 10^6 individual clones

電気的形質転換法を用いた cDNA ライブラリーの作製(農芸化学部門)

電気的形質転換法を用いプラスミドDNAを導入することにより大腸菌を形質転換した。我々は高効率を得る工夫をし, この方法を用いることでコンピテントセルを用いる形質転換法(Hanahan法)では出せない高効率を得ることが可能になった。ここではこの方法で登熟期イネ胚乳及びホウレンソウ芽生えよりcDNAライブラリーの作製に成功した。To transform Escherichia coli a plasmid DNA was introduced by electroporation. We improved transformation efficiency adding several chemicals, biological materials and/or preheating of the buffer solution which was added just affer electrodischarge. The improved method gave higher transformation efficiency comparing with that of Hanahan\u27s. cDNA libraries for mRNAs appearing in the developing rice seeds and spinach seedlings were constructed using this method

電気的ブロッティング法を用いる cDNA クローンの抗体スクリーニング(農芸化学部門)

大腸菌発現ベクターpUC 9を用いて作製したcDNAライブラリーから電気的ブロッティング法を用いる抗体スクリーニングを行った。ここに示す電気的ブロッティング法を使用すると, 従来の抗体スクリーニング法で障害となる非特異的吸着によるバックグラウンドをほとんど除去出来た。ここでは, 登熟期イネ種子について作製したcDNAライブラリーより, プロラミン抗体を用いてプロラミンcDNAの一つをスクリーニングする過程を例として示し, この方法の特徴を解説する。A cDNA library constructed using plasmid expression vector, pUC 9,was screened immunologically after the products of the transformed cells were electrically transfered to nitrocellulose filter. Electroblotting technic mentioned here reduced remarkably the background which interfered strongly the identification of the target clones. In this paper, an example is shown in which a clone carring rice prolamin cDNA sequence was screened from a cDNA library for developing rice seed using the electroblotting technic

イネ(日本晴)ゲノム P1 ライブラリーの構築(農芸化学部門)

プロトプラスト化せず, イネ若葉より1Mb程度の高分子量核DNAを調製する手法を確立した。制限酵素Mbo Iにより部分消化した後, 70-95kbのイネゲノムDNA断片を得た。このDNAを材料として, P1クローニングシステムを用いてイネゲノムライブラリーを構築した。任意に選択したクローンよりプラスミドを回収し, 制限酵素Not Iで切断し電気泳動した結果, このライブラリーは平均85kbのインサートDNAを持つプラスミドによって構成されていることが分かった。We constructed a P1 library containing 70-95kb inserts of rice genomic DNA. The high molecular weight DNA was obtained from rice young leaves by a simple liquid nitrogen method. The high molecular weight DNAs were partially digested with restriction enzyme Mbo I, and ligated into P1 vector. This library consisted about 2,000 individual clones, and was expected to be useful for large scale genomic analyses