Ecologia Molecular de leveduras negras

Resumo: As leveduras negras são Ascomicetos cuja principal característica é a pigmentação escura na parede celular das células vegetativas e reprodutivas, e pertencem às ordens Dothideales e Chaetothyriales. O oligotrofismo destes agentes os torna hábeis a sobreviver em diversos substratos. Sendo assim, estudos da ecologia destes agentes são de fundamental importância para o entendimento da evolução epidemiológica das doenças causadas por estes micro-organismos. O presente trabalho teve como objetivo estudar a ecologia de leveduras negras e avaliar a atividade de enzimas fenoloxidase e lacase visando à aplicação biotecnológica. Neste estudo foram utilizadas 43 linhagens de diferentes gêneros de leveduras negras. A termotolerância foi determinada num intervalo de 15 a 40ºC. A tolerância ao pH foi verificada num intervalo de 2,5 a 9 em intervalos de 0,5. A atividade enzimática foi verificada em placas com meio sólido contendo os substratos Guaiacol 0,2% para enzima lacase e ácido tânico 0,5% para enzima fenoloxidase. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens de Exophiala apresentaram melhor crescimento entre 24 e 30°C. Os isolados ambientais pertencentes ao gênero Cladophialophora apresentaram crescimento a 40 °C, sendo o ótimo a 33ºC. Quanto ao pH, a faixa ótima para o crescimento das linhagens variou entre 4 e 5,5. De maneira geral, as linhagens toleram uma ampla variação de pH, sendo que foi observado uma preferência ao pH ligeiramente ácido. Seis linhagens apresentaram atividade fenoloxidase e todas apresentaram atividade para a enzima lacase. As quatro linhagens selecionadas para a assimilação de hidrocarbonetos foram capazes de crescer na presença destes compostos. A partir destes resultados, verificou-se que as linhagens estudadas apresentaram variação em relação à tolerância a temperatura, pH e atividade enzimática testada, o que pode representar diferenças no potencial de virulência e esclarecer os diferentes perfis epidemiológicos destes agentes, assim como identificar isolados com potencial biorremediador

Molecular identification of non-conventional yeasts and the screening for α-terpineol assimilation: Identificação molecular de leveduras não convencionais e triagem para assimilação de α-terpineol

The present research aimed to analyze the potential consumption of a monoterpene compound, α-terpineol, by aroma-producing Yeasts. For this purpose, 23 non-conventional yeasts were selected and identified by molecular tools. Subsequently, a screening test was performed to evaluate their tolerance to α-terpineol, by cultivating them in YM broth, at pH 5.0, for 48 h. A mixture of α-terpineol and ethyl alcohol was added to the broth in concentrations ranging from 2.5 to 10.0 μL/mL (intervals of 2.5). The yeasts that survived any of these concentrations were cultured again, but this time in mineral DP liquid culture medium to assess the consumption of α-terpineol. TLC analysis was conducted to analyze the consumption of α-terpineol. The yeasts studied were identified as Clavispora lusitaniae (n=12), Rhodotorula mucilaginosa (n=8), and Lodderomyces elongisporus (n=3). Furthermore, according to the phylogenetic tree, two of these strains (C. lusitaniae and L. elongisporus) have greater genetic proximity than the yeast R. mucilaginosa. From the 23 yeasts, 6 of them were shown to be tolerant to the concentration of 2.5 μL/mL of α-terpineol. The tolerant strains were identified as C. lusitaniae (n = 1), L. elongisporus (n = 2), and R. mucilaginosa (n = 3). However, the yeast that resisted the highest concentration, R. mucilaginosa, was only 12 hours in all concentrations. It is more likely that the defense mechanism of the yeast was not able to prevent further damage to the membrane as the time in contact with α-terpineol increased. The TLC results showed that the extracts from R. mucilaginosa (CMRP3205) and L. elongisporus (CMRP3192) could be interpreted as potentially promising results of new compounds production by the yeasts

Chaetothyriales : Biodiversity, infective ability and biotechnological potential

Orientadora : Profª Drª Gerrit Sybren de HoogCoorientadora : Profª Drª Vania Aparecida VicenteTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 31/03/2017Inclui referências ao final de cada capítuloResumo: Todas as leveduras negras membros da ordem Chaetothyriales apresentam melanina na parede celular, um ciclo de vida polimórfico, com uma ecologia significativamente variável, e inclui cinco famílias, Chaetothyriaceae, Cyphellophoraceae, Epibryaceae, Herpotrichiellaceae e Trichomeriaceae. Por um lado, a família Herpotrichiellaceae tem sido a mais estudada, sendo caracterizada por uma ecologia complexa, que compreende espécies consideradas sapróbias, espécies com importância clínica e habilidades assimilativas de hidrocarbonetos monoaromáticos. Por outro lado, a família Trichomeriaceae é uma família recentemente estabelecida e inclui principalmente organismos epífitos e epilíticos. Com base nessa variável e complexa ecologia dos membros da ordem Chaetothyriales, o objetivo da tese foi estudar a diversidade e ecologia da ordem Chaetothyriales com foco em Herpotrichiellaceae e Trichomeriaceae, duas famílias distintas em ecologia e características. Por esta razão, a tese foi dividida em capítulos. A diversidade de leveduras pretas em cascas de coco de babaçu foi investigada aplicando diferentes técnicas de isolamento (Capítulo II). Os isolados de levedura negras obtidos foram identificados pelo sequenciamento da região ITS. Entre os isolados, foram reconhecidas espécies com importância clínica como Veronaea botryosa, Rinhocladiella similis e Exophiala spinifera e duas novas espécies foram descritas na família Herpotrichiellaceae. A capacidade de crescer em tolueno e fenilacetato como única fonte de carbono e energia foi avaliada para oito linhagens. Em relação ao fenilacetato, um composto intermediário da via de degradação do estireno, todas as estirpes testadas foram capazes de assimilar o composto, no entanto, apenas dois isolados assimilam tolueno. A presença de compostos aromáticos voláteis (VOCs) no coco de babaçu foi investigada utilizando GC-ToFMS, e foram identificados um total de 140 compostos, sendo o álcool o composto mais abundante (2023 ?g m-3). O gênero Arthrocladium foi restabelecido com base nas análises filogenéticas e atribuído a família Trichomeriaceae (Capítulo IV). A identificação preliminar baseada no sequenciamento da região ITS mostrou que as três espécies não descritas se agrupavam próximas a Arthrocladium caudatum, linhagem tipo do gênero. A análise em multilocus confirmou a posição filogenética destas espécies assim como a posição taxonômica do género na família Trichomeriaceae. Com base nesta inferência foram descritas três espécies sem esporulação procedentes de diferentes substratos tais como, o coco da palmeira babaçu, formigas e de amostras de tecido cerebral a partir de uma infecção disseminada fatal em um paciente com distúrbio imunológico genético. Os resultados deste estudo nos levaram a elucidar alguns aspectos da ecologia das leveduras negras, bem como desvendar o potencial biotecnológico dos microrganismos de procedência ambiental. Palavras-chave: diversidade, Trichomeriaceae, Herpotrichiellaceae, assimilação de tolueno, fungos sem esporulaçãoAbstract: All black yeasts members of the Chaetothyriales order presents melanin in the cell wall, a polymorphic life cycle, with a significantly variable ecology, which includes five families, Chaetothyriaceae, Cyphellophoraceae, Epibryaceae, Herpotrichiellaceae and Trichomeriaceae. On the one hand, Herpotrichiellaceae has been the most studied family, characterized by a complex ecology, which comprises species considered saprobes, species with clinical importance and assimilative abilities of monoaromatic hydrocarbons. On the other hand, the family Trichomeriaceae is a recently established family and mostly includes epiphytic and epilithic organisms. Based on this variable and complex ecology of the Chaetothyriales members, the purpose of the thesis was to study diversity in Chaetothyriales focusing in Herpotrichiellaceae and Trichomeriaceae, two distinct families in ecology and characteristics. The diversity of black yeast in babassu coconut shells was investigated applying different isolation techniques (Chapter II). One-hundred and sixty isolates of black yeast isolates obtained were identified by the sequencing of ITS region. Among the isolates, species with clinical importance as Veronaea botryosa, Rinhocladiela similis and Exophiala spinifera were recognized and two novel species were described in Herpotrichiellaceae. The ability to grow on toluene and phenyl acetate as the sole carbon and energy source was assessed in eight strains. Regarding to the phenyl acetate, an intermediate compound of styrene degradation route, all strains tested were able to assimilate the compound however only two isolates assimilates toluene. The presence of Volatile aromatic compounds (VOCs) in the babassu coconut were investigated using GC-ToFMS, and a total of 140 compounds were identified, which alcohol was the most abundant compound (2023 ?g m-3). The genus Arthrocladium were re-established based on the phylogenetic analyses and assigned to Trichomeriaceae family (Chapter IV). Preliminary identification based on the sequencing of ITS region showed three undescribed species clustering near to Arthrocladium caudatum. Additional multilocus analysis confirms the phylogenetic position of the undescribed species and the position of the genus in Trichomeriaceae. Three non-sporulating species were described, one of the species was isolated from babassu coconut, another associated with ants and one of them from a fatal disseminated infection in a patient with a genetic immune disorder. The findings in this study led us to elucidate some aspects in the ecology of black yeast, as well unravel the biotechnological potential of these microorganisms. Keys-words: diversity, Trichomeriaceae, Herpotrichiellaceae, toluene assimilation, non-sporulating fung

Ecologia Molecular de leveduras negras

Resumo: As leveduras negras são Ascomicetos cuja principal característica é a pigmentação escura na parede celular das células vegetativas e reprodutivas, e pertencem às ordens Dothideales e Chaetothyriales. O oligotrofismo destes agentes os torna hábeis a sobreviver em diversos substratos. Sendo assim, estudos da ecologia destes agentes são de fundamental importância para o entendimento da evolução epidemiológica das doenças causadas por estes micro-organismos. O presente trabalho teve como objetivo estudar a ecologia de leveduras negras e avaliar a atividade de enzimas fenoloxidase e lacase visando à aplicação biotecnológica. Neste estudo foram utilizadas 43 linhagens de diferentes gêneros de leveduras negras. A termotolerância foi determinada num intervalo de 15 a 40ºC. A tolerância ao pH foi verificada num intervalo de 2,5 a 9 em intervalos de 0,5. A atividade enzimática foi verificada em placas com meio sólido contendo os substratos Guaiacol 0,2% para enzima lacase e ácido tânico 0,5% para enzima fenoloxidase. Os resultados obtidos mostraram que as linhagens de Exophiala apresentaram melhor crescimento entre 24 e 30°C. Os isolados ambientais pertencentes ao gênero Cladophialophora apresentaram crescimento a 40 °C, sendo o ótimo a 33ºC. Quanto ao pH, a faixa ótima para o crescimento das linhagens variou entre 4 e 5,5. De maneira geral, as linhagens toleram uma ampla variação de pH, sendo que foi observado uma preferência ao pH ligeiramente ácido. Seis linhagens apresentaram atividade fenoloxidase e todas apresentaram atividade para a enzima lacase. As quatro linhagens selecionadas para a assimilação de hidrocarbonetos foram capazes de crescer na presença destes compostos. A partir destes resultados, verificou-se que as linhagens estudadas apresentaram variação em relação à tolerância a temperatura, pH e atividade enzimática testada, o que pode representar diferenças no potencial de virulência e esclarecer os diferentes perfis epidemiológicos destes agentes, assim como identificar isolados com potencial biorremediador

Black yeasts-like fungi isolated from dialysis water in hemodialysis units

Hemodialysis in patients with chronic renal failure promotes the removal of toxic substances, water, and minerals from the body and often takes place in specialized clinics. Microbial contamination of dialysis fluid is a serious problem in therapy. One of the sources of contamination is the water used to prepare the dialysate. In Brazil, legislation regulating the microbiological quality of water for dialysis does not cover waterborne microbes such as Pseudomonas, mycobacteria, and fungi. The aim of the present study was to quantify, isolate, and identify fungi present in water systems in six hemodialysis units in Curitiba, Parana state, Brazil. Fungi were analyzed by surface plating and membrane filtration. Isolates were identified by morphology, while the dematiaceous fungi were identified by sequencing the rDNA ITS region. It was found that 66 % of the samples presented fungi, while black fungi were present in 46 % of all samples. Twenty-eight isolates from treated water for dialysis and dialysate were identified by sequencing and were found to be Exophiala pisciphila, E. cancerae, E. equina, and Rhinocladiella similis. The presence of dematiaceous fungi may pose a risk for debilitated hospitalized patients

Detection of Streptococcus mutans using padlock probe based on Rolling Circle Amplification (RCA)

The aim of this study was to develop and evaluate a padlock probe based on the Rolling Circle Amplification (RCA), which targeted to 16S-23S rDNA region of S. mutans. The specificity of developed padlock probe was tested for DNA within a panel strains, including S. mutans isolated from the saliva and reference strains of the genus Streptococcus, as well as total DNA samples of biofilm and saliva. The results were positive either for DNA samples of S. mutans or DNA samples recovered from the biofilm and saliva revealing the specificity of designed padlock probe. The padlock probe based on the RCA was proved to be an effective, reproducible method for S. mutansdetection and demonstrated the possibility of a rapid detection and accurate identification of S. mutans infection

Shared Physiological Traits of Exophiala Species in Cold-Blooded Vertebrates, as Opportunistic Black Yeasts

Several species of the genus Exophiala are found as opportunistic pathogens on humans, while others cause infections in cold-blooded waterborne vertebrates. Opportunism of these fungi thus is likely to be multifactorial. Ecological traits [thermotolerance and pH tolerance, laccase activity, assimilation of mineral oil, and decolorization of Remazol Brilliant Blue R (RBBR)] were studied in a set of 40 strains of mesophilic Exophiala species focused on the salmonis-clade mainly containing waterborne species. Thermophilic species and waterborne species outside the salmonis-clade were included for comparison. Strains were able to tolerate a wide range of pHs, although optimal growth was observed between pH 4.0 and 5.5. All strains tested were laccase positive. Strains were able to grow in the presence of the compounds (mineral oil and RBBR) with some differences in assimilation patterns between strains tested and also were capable of degrading the main chromophore of RBBR. The study revealed that distantly related mesophilic species behave similarly, and no particular trend in evolutionary adaptation was observed

Comparative Genomics of Sibling Species of Fonsecaea Associated with Human Chromoblastomycosis

Submitted by Manoel Barata ([email protected]) on 2018-02-09T13:19:12Z No. of bitstreams: 1 FaoroComparativ.pdf: 5399928 bytes, checksum: af51deed6d3e60618950577e576e6aad (MD5)Approved for entry into archive by Manoel Barata ([email protected]) on 2018-05-03T19:30:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 FaoroComparativ.pdf: 5399928 bytes, checksum: af51deed6d3e60618950577e576e6aad (MD5)Made available in DSpace on 2018-05-03T19:30:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 FaoroComparativ.pdf: 5399928 bytes, checksum: af51deed6d3e60618950577e576e6aad (MD5) Previous issue date: 2017Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Utrecht, Netherlands / University of Amsterdam. Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics. Amsterdam, Netherlands.Universidade Federal do Paraná. Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular. Brasilia, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular. Brasilia, Brasil.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention. Guangdong Provincial Institute of Public Health, Guangzhou, China.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. São Paulo, SP, Brasil.Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. São Paulo, SP, Brasil.Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular. Brasilia, Brasil / Northern Arizona University. Pathogen and Microbiome Institute. Flagstaff, United States.Universidade Católica de Brasília. Departamento de Ciências Genômicas e Biotecnologia. Brasília, DF, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de Campinas. Divisão de Recursos Microbianos. Campinas, SP, Brasil.Mashhad University of Medical Sciences. School of Medicine. Department of Parasitology and Mycology. Mashhad, Iran.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Hospital das Clínicas. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Utrecht, Netherlands / University of Amsterdam. Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics. Amsterdam, Netherlands.Fonsecaea and Cladophialophora are genera of black yeast-like fungi harboring agents of a mutilating implantation disease in humans, along with strictly environmental species. The current hypothesis suggests that those species reside in somewhat adverse microhabitats, and pathogenic siblings share virulence factors enabling survival in mammal tissue after coincidental inoculation driven by pathogenic adaptation. A comparative genomic analysis of environmental and pathogenic siblings of Fonsecaea and Cladophialophora was undertaken, including de novo assembly of F. erecta from plant material. The genome size of Fonsecaea species varied between 33.39 and 35.23 Mb, and the core genomes of those species comprises almost 70% of the genes. Expansions of protein domains such as glyoxalases and peptidases suggested ability for pathogenicity in clinical agents, while the use of nitrogen and degradation of phenolic compounds was enriched in environmental species. The similarity of carbohydrate-active vs. protein-degrading enzymes associated with the occurrence of virulence factors suggested a general tolerance to extreme conditions, which might explain the opportunistic tendency of Fonsecaea sibling species. Virulence was tested in the Galleria mellonella model and immunological assays were performed in order to support this hypothesis. Larvae infected by environmental F. erecta had a lower survival. Fungal macrophage murine co-culture showed that F. erecta induced high levels of TNF-α contributing to macrophage activation that could increase the ability to control intracellular fungal growth although hyphal death were not observed, suggesting a higher level of extremotolerance of environmental species