Phytochemistry and evaluation of the photoinduced biological effect of extracts and isolated substances from Annonaceae (plant in nature and obtained by cell culture)

Orientador: Marcos José SalvadorTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O objetivo do estudo químico, biológico e biotecnológico de duas espécies de Annonaceae (Annona cacans, Annona mucosa, Annona squamosa, ou Guatteria hispida) foi buscar substâncias bioativas e fotoativadas nestas matrizes vegetais (plantas in natura e obtidas por cultura de células). O estudo dos extratos brutos metanólicos foi realizado monitorando o espectro de absorção na região de interesse em terapia fotodinâmica (600 a 800 nm), na análise do espectro de fluorescência (modo emissão e excitação), na avaliação da eficiência fotoquímica e nos resultados dos bioensaios, incluindo a avaliação do efeito biológico fotoinduzido por radiação laser a 660 nm em modelo experimental in vitro de terapia fotodinâmica antimicrobiana (PDT-antimicrobiana). Para tanto, procedeu-se a adequação de metodologia para os ensaios biologicos em PDT-antimicrobiana e o desenvolvimento de procedimentos analíticos, incluindo o estudo fitoquímico biomonitorado, obtendo-se inicialmente o perfil químico (CCDC, CG, CLAE, RMN ou ESI-MS). Os resultados possibilitaram a identificação de 11 alcalóides já descritos em literatura para espécies de Annonaceae diretamente nos extratos brutos (desreplicação). Após a etapa de triagem e por comparação entre os resultados obtidos foi possível definir a G. hispida e A. squamosa como as espécies mais promissoras para as quais continuou-se o estudo. As demais espécies apresentaram baixa absorção e fluorescência na região de interesse em PDT e baixa eficiência fotoquímica. Os extratos das duas espécies escolhedas com substâncias que não puderam ser identificadas na etapa de desreplicação foram submetidos ao fracionamento biomonitorado e para as substâncias isoladas e purificadas realizou-se a sua determinação estrutural utilizando-se métodos espectroscópicos de análise o que possibilitou a identificação de 5 alcalóides: os alcalóide Isomoschatolina e 9-metoxi-isomoschatolina foram isolados apenas das amostras de G. hispida e o alcalóide Palmatina isolado apenas do extrato de A. squamosa, enquanto os alcalóides Anonaina e Liriodenina foram isolados dos extratos das duas espécies. No estudo biotecnológico procedeu-se o estabelecimento e desenvolvimento de culturas de células das duas espécies vegetais mais promissoras nos bioensaios, visando, além do estudo fitoquímico, a manipulação de fatores físicos e químicos para a produção de metabólitos secundários e o estudo comparativo dos metabólitos bioativos nas culturas de células e aqueles obtidos de partes da planta in natura. Foram obtidos calos friáveis e livres de oxidação para as duas espécies. O estudo comparativo dos espectros de ESI-MS/MS dos extratos bioativos mostrou similaridades entre a composição dos extratos da planta in natura com o obtido por cultura de células e possibilitou a quantificação por UHPLC-MS de alguns alcalóides já descritos para espécies de Annonaceae nas amostras estudadas, incluindo os alcalóides asimilobina, Liriodenina, lisicamina e Palmatina que apresentam potencial para aplicação em PDT antimicrobiana observando-se similaridades nos resultados em termos químicos e biológicos. Em colaboração com o "Laboratoire Jean Perrin, Campus Jussieu, Université Pierre et Marie Curie, em Paris, França", foram realizados alguns estudos dos alcalóides isoquinolínicos, tais como, Isomoschatolina (Gh1) e Palmatina (As3) sozinhos e associados à ciclodextrina. Os estudos sugerem que esses alcalóides quando complexados são melhor direcionados no interior das células tumorais e se concentram predominantemente nos lisossomosAbstract: he aim of the study chemical, biological and biotechnological of two Annonaceae¿s species (Annona Cacans, Annona mucosa, Annona squamosa or Guatteria hispida) went for bioactive substances and photoactivated these plant matrices (plants in nature and obtained by cell culture). The study of methanolic crude extract was carried out by monitoring the absorption spectrum in the region of interest in photodynamic therapy (600 to 800 nm), the fluorescence spectrum analysis (mode emission and excitation), the evaluation of the photochemical efficiency and the results of bioassays including assessment of the biological effect photoinduced by laser radiation at 660 nm in an experimental model in vitro antimicrobial photodynamic therapy (PDT-antimicrobial). Therefore, we proceeded to fit methodology for biological testing PDT-antimicrobial and development of analytical procedures including the study bioactivity Phytochemistry, obtaining initially a chemical profile (CCDC, GC, HPLC, NMR and ESI-MS ). The results allowed the identification of 11 alkaloids already described in literature for Annonaceae species directly in crude extracts (dereplication). After the step of screening and by comparing the results obtained it was possible to define G hispida and. A. squamosa as the most promising species for which continued the study. The other species showed low absorption and fluorescence in the region of interest in PDT and low photochemical efficiency. The extracts of the two select species with substances that could not be identified in dereplication stage underwent biomonitored fractionation and isolated substances and purified held its structural determination using spectroscopic methods of analysis which enabled the identification of 5 alkaloids: alkaloid Isomoschatoline and 9-methoxy-isomoschatoline were isolated only from samples G. hispida and Palmatine alkaloid isolated only from A. squamosa extract while Anonaina and liriodenine alkaloids have been isolated from two species of the extracts. In biotechnology study proceeded to the establishment and development of cell cultures of the two most promising species in bioassays, aimed beyond the phytochemical study, the handling of physical and chemical factors for the production of secondary metabolites and the comparative study of bioactive metabolites in cell cultures and those obtained from the fresh plant parts. Friable callus and oxidation free were obtained for the two species. The comparative analysis of ESI-MS / MS spectra of the bioactive extracts showed similarities between the composition of the plant extracts in nature to that obtained by cultivating cells and allowed the quantitation UHPLC-MS some alkaloids already described for species of Annonaceae in samples studied, including Asimilobine alkaloids, Liriodenine, Lysicamine and Palmatine that have potential for use in antimicrobial PDT observing similarities in results in chemical and biological terms. In collaboration with the "Laboratoire Jean Perrin, Campus Jussieu, Université Pierre et Marie Curie in Paris, France," were carried out some studies of isoquinoline alkaloids, such as Isomoschatoline (GH1) and Palmatine (AS3) alone and associated with the cyclodextrin. Studies suggest that these alkaloids are best directed when complexed within tumor cells and predominantly concentrated in the lysosomesDoutoradoBiologia VegetalDoutora em Biologia Vegetal2011/18315-2FAPES

Bioprospecting of photosensitizers and natural bioactive substances in Eugenia chlorophylla and development of analytical procedures

Orientador: Marcos José SalvadorDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Este estudo teve por objetivo a prospecção químico-farmacológica de fotossensibilizadores naturais para aplicação em terapia fotodinâmica (PDT) antimicrobiana e de substâncias bioativas acumuladas no extrato etanólico das folhas de Eugenia chlorophylla (Myrtaceae), bem como a caracterização química e da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, caule e flores desta espécie vegetal. Para tanto, procedeu-se o preparo do extrato vegetal bruto (hexânico e etanólico) a partir das folhas de E. chlorophylla e a avaliação da absorção de luz na região espectral do visível de interesse e útil para aplicação em PDT. O extrato bruto etanólico foi submetido a uma extração líquido-líquido com hexano, diclorometano e butanol. Os melhores resultados na avaliação da absorção de luz na região espectral do visível de interesse e útil para aplicação em PDT foram obtidos com o extrato bruto e com a fração diclorometânica da partição, para os quais foram avaliadas suas características fluorescentes em estado estacionário no modo de emissão e excitação (caracterização preliminar de suas propriedades fotoquímicas e fotofísicas). Desenvolveuse a adequação de metodologia para uma avaliação inicial da eficiência fotoquímica dos extratos e frações obtidos (produção de oxigênio singlete, ensaio, 1,3 - diphenylisobenzofuran (DPBF), bem como adequou-se os procedimentos para a realização dos bioensaios na presença e ausência de luz. Procedeu-se a avaliação da atividade antimicrobiana in vitro com o extrato bruto etanólico e suas frações da partição líquidolíquido, na ausência de irradiação laser, determinando-se os valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) para as amostras bioativas e estimando-se os valores de concentração subinibitória que seriam usados na PDT atimicrobiana. Ainda, foram estabelecidos os procedimentos para a padronização do protocolo experimental de PDT antimicrobiana frente a bactérias (Gram positivas e Gram negativas) e leveduras in vitro e avaliou-se o efeito do extrato bruto etanólico e da fração diclorometânica como fotossensibilizadores naturais em PDT antimicrobiana, utilizando-se 11 cepas indicadoras. De acordo com os resultados obtidos o extrato bruto etanólico (ECB) e sua fração diclorometânica (ECD) apresentaram absorção de luz na região de 600 a 800 nm, demonstrou a capacidade de formar oxigênio singlete no ensaio com DPBF quando irradiados pelo laser e apresentou resultado efetivo na inativação de algumas das cepas indicadoras (bactérias e leveduras) em PDT antimicrobiana quando irradiados em sessão única por 5 min com laser diodo InGaAlP, ?=660nm. A partir dos resultados dos ensaios com DPBF e com a utilização de inibidores específicos do mecanismo fotoquímico em modelo biológico sugeriu-se que o mecanismo fotoquímico predominante para ECD é o do tipo II (mediado pela formação de oxigênio singlete). Deu-se inicio ao estudo fitoquímico monitorado pela absorção de luz na região do visível (400 a 830 nm), pela avaliação da eficiência fotoquímica e pelas atividades biológicas. Pelo resultado do estudo de desreplicação por ESI-MS/MS do extrato etanólico bruto e da fração ECD sugeriu-se a presença do ácido quínico nestas amostras. Como as folhas frescas de E. chlorophylla apresentavam odor intenso e neste projeto foi proposto também estudo para a prospecção de substâncias bioativas, realizou-se um estudo para a caracterização química e avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das folhas, caule e flores desta espécie vegetal. A caracterização química dos constituintes majoritários do óleo essencial foi realizada por cromatografia gasosa (CG-EM). Os óleos essenciais das folhas, caule e flores de E. chlorophylla foram obtidos por hidrodestilação e apresentaram rendimento de 0,01 a 0,1%. Setenta e cinco componentes foram identificados, representando mais de 85% do total do óleo. Os principais componentes detectados nos óleos essenciais foram Ecariofileno (flores), óxido de cariofileno (caule, flores e folhas), globulol (caules e folhas) e T-muurolol, 1-epi-cubenol e ?-cadinol (caule, flores e folhas). Todos os óleos mostraram leve a moderada atividade antimicrobiana (na ausência de radiação laser), sobre principalmente as bactérias Gram positivas e Candida albicans, sendo estes resultados similares ao observado na literatura para esta espécie vegetal, com exceção do óleo do caule, coletado em 2011, que não se mostrou ativo nas condições experimentais utilizadas e é composto, predominantemente (85,4%) por um constituinte alifático para o qual não foi possível identificar a estrutura química por CG-EM. Ainda, observou-se variação nos valores de concentração inibitória mínima frente às cepas bioativas dependendo do ano de coleta e armazenagem dos óleos essenciais obtidosAbstract: This study aimed at making a chemical-pharmacological search for prospection of natural photosensitizers in photodynamic therapy (PDT) and of bioactive compounds accumulated in the ethanolic extract of leaves from Eugenia chlorophylla (Myrtaceae) and to study the chemical characterization and antimicrobial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of this plant species. For this purpose, we carried out the preparation of the crude plant extract (hexane and ethanol) from the leaves of E.chlorophylla followed by the assessment of light absorption in the visible spectral region of interest could be useful for application in PDT. The crude ethanol extract was subjected to a liquid-liquid extraction with hexane, dichloromethane and butanol. The best results for the absorption of light in the visible spectral region of interest to gets with usefulness for application in PDT were obtained for the crude extract and dichloromethane fraction, which were evaluated for their characteristics in steady-state fluorescent emission mode and excitement (preliminary characterization of photochemical properties). Still, it has adequate methodology was developed for an initial assessment of the photochemical efficiency of extracts (production of singlet oxygen, DPBF test 1.3-diphenylisobenzofuran) as well as the adequate conformed for the achievement of bioassays in the presence and absence of light. Evaluation of antimicrobial activity was carried out in vitro with a crude ethanol extract and their fractions from liquid-liquid partition, in the absence of laser irradiation, determining the values of minimum inhibitory concentration (MIC) in antimicrobial testes for bioactive samples and estimating the sub-inhibitory concentration values which would be used in antimicrobial PDT. Standardization of the experimental protocol of in vitro antimicrobial PDT was carried out against Gram positive and Gram-negative bacteria and yeast the effect of the crude ethanol extract and the dichloromethane fraction evaluated as natural photosensitizes in antimicrobial PDT using 11indicator strains. According to results obtained from the crude ethanol extract (ECB) and its dichloromethane fraction (ECD) showed light absorption in the region from 600 to 800 nm, it was demonstrated that singlet oxygen was formed in the assay with DPBF when irradiated by laser ( ?=660nm) showed effective results in the inactivation of antimicrobial PDT in some of the indicator strains (bacteria and yeasts) when irradiated in a single session for 5 min with InGaA1P laser diode. Along with the test result with DPBF, research using specific inhibitors of the photochemical mechanism in a biological model suggests that the dominant photochemical mechanism for ECD is the type II (mediated by the formation of singlet oxygen). We carried out the phytochemical study monitored by light absorption in the visible region (400 to 830nm), in which the evaluation of photochemical efficiency and biological activities and the results of the study of dereplication of the crude ethanolic extract and the ECD fraction by ESI-MS/MS suggest the presence of quinic acid in these samples. Since the fresh leaves of E. chlorophylla have an intense smell and this project also contemplated a search for bioactive substances a study was carried out for the chemical characterization and antimicrobial activity of essential oils from leaves, stems and flowers of the plant species. The chemical characterization of the major constituents of the essential oil was performed by gas chromatography (GC-MS). Essential oils from leaves, stems and flowers of E. chlorophylla were obtained by hydrodistillation and presented a yield of 0.01 to 0.1%. Seventy-five compounds were identified, representing over 85% of the total oil. The main components were E-caryophyllene (flowers), caryophyllene oxide (stem, leaves and flowers), globulol (stems and laves) and T-muurolol, 1-epi-? cubenol, and ?-cadinol (stem, leaves and flowers). All essential oils studied showed mild to moderate antimicrobial activity mainly associated with Gram positive bacteria and Candida albicans with results similar to those observed in the literature for this plant species. An exception was the stem oil collected in 2011 that was not active in the experimental conditions used and is constituted predominantly (85.4%) for an aliphatic constituent not identified by GC-MS. Was verified variation in the minimum inhibitory concentration values of essential oils of E. chlorophylla with the year of collect and with storage timeMestradoBiologia VegetalMestre em Biologia Vegeta

Germinação e envelhecimento acelerado na análise da qualidade fisiológica de sementes de alfavaca-cravo

O estudo teve como propósito contribuir para o estabelecimento de parâmetros para análise da qualidade fisiológica de sementes de alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum L.), uma vez que a referida espécie não se encontra entre as descritas nas Regras para Análise de Sementes. Foram utilizadas sementes de alfavaca-cravo, colhidas no Campus da UENP-CLM, Bandeirantes-PR, submetidas a análises de teor de água, germinação, envelhecimento acelerado com água e solução salina, tetrazólio e emergência de plântulas. A temperatura de 30 ºC para o teste de germinação e o substrato areia para o teste de emergência de plântulas são condições e procedimentos apropriados para avaliação da qualidade fisiológica de sementes de O. gratissimum. O teste de envelhecimento, independente do tipo de solução utilizada, apresenta  correlação com o teste de emergência de plântulas em solo. O baixo potencial germinativo e viabilidade das sementes de O. gratissimum ocorrem em função da deterioração e ausência dos tecidos internos.The study aimed to contribute to establish parameters for analyzing the physiological quality of seed-clove basil (Ocimum gratissimum L.), since the species is not among those described in the Rules for Testing Seeds. Seeds of basil, clove, gathered on the campus of UENP-CLM, Bandeirantes, PR, analyzed for water content, germination, accelerated aging water and saline tetrazolium and seedling emergence. The temperature of 30 ° C for the germination test and the sand substrate for the emergence test are conditions and procedures for evaluating the physiological quality of seeds of O. gratissimum. The aging test, regardless of the type of solution used, the test is correlated with seedling emergence in soil. The low germination and seed viability of O. gratissimum occurring due to deterioration and lack of internal tissue

Multiple LEDT wavelengths modulate the Akt signaling pathways and attenuate pathological events in mdx dystrophic muscle cells

This study is aimed at investigating the effects of LEDT, at multiple wavelengths, on intracellular calcium concentration; on transient receptor potential canonical channels; on calcium-binding protein; on myogenic factors; on myosin heavy chains; on Akt signaling pathway; on inflammatory markers; and on the angiogenic-inducing factor in dystrophic muscle cell culture experimental model. Dystrophic primary muscle cells were submitted to LEDT, at multiple wavelengths (420 nm, 470 nm, 660 nm, and 850 nm), and evaluated after 48 h for cytotoxic effects and intracellular calcium content. TRPC-1, TRPC-6, Calsequestrin, MyoD, Myogenin, MHC-slow, MHC-fast, p-AKT, p-mTOR, p-FoxO1, Myostatin, NF-κB, TNF-α, and VEGF levels were evaluated in dystrophic primary muscle cells by western blotting. The LEDT, at multiple wavelengths, treated-mdx muscle cells showed no cytotoxic effect and significant lower levels in [Ca2 +]i. The mdx muscle cells treated with LEDT showed a significant reduction of TRPC-1, NF-κB, TNF-α and MyoD levels and a significant increase of Myogenin, MHC-slow, p-AKT, p-mTOR, p-FoxO1 levels, and VEGF levels. Our findings suggest that different LEDT wavelengths modulate the Akt-signaling pathways and attenuate pathological events in dystrophic muscle cells, and a combined multiwavelength irradiation protocol may even provide a potentially therapeutic strategy for muscular dystrophies

Plant extracts in the control of aphids Brevicoryne brassicae (L.) and Myzus persicae (Sulzer)<br/>Extratos vegetais no controle dos afídeos Brevicoryne brassicae (L.) e Myzus persicae (Sulzer)

Were accomplished the effect of plant extracts of clove basil (Ocimum gratissimum L.), horsetail (Equisetum hyemale L.), coriander (Coriandrum sativum L.) and tobacco (Nicotiana tabacum L.) on Brevicoryne brassicae (L., 1758) and Myzus persicae (Sulzer, 1776) aphids in cabbage Brassica oleracea (L.). The treatments consisted of plant extracts prepared fresh and dry (concentrations of 2.5; 5.0; and 10%) and the controls insecticide acephate and water. These solutions were sprayed on cabbage discs placed on agar in Petri dishes, containing twenty adult aphids. In sequence, the Petri dishes were sealed with plastic film and this procedure was repeated for the two aphid species studied. The assessment of the number of live nymphs and adults occurred at 1, 12, 24, and 72 hours after installation. The extracts of coriander and tobacco prepared in a concentration of 10% showed toxic effects similar to the organophosphate insecticide acephate, on adults and nymphs of the aphids Brevicoryne brassicae and Myzus persicae. Coriander revealed a promising alternative that deserves detailed studies regarding the performance of its active ingredients and dosage determination in order to provide a safe herbal product to control insects.<p><p>Avaliou-se o efeito de extratos vegetais de alfavaca-cravo (Ocimum gratissimum L.), cavalinha (Equisetum hyemale L.), coentro (Coriandrum sativum L.) e fumo (Nicotiana tabacum L.) sobre os pulgões Brevicoryne brassicae (L., 1758) e Myzus persicae (Sulzer, 1776) em couve Brassica oleracea (L.). Os tratamentos consistiram de extratos vegetais preparados a fresco e seco (nas concentrações de 2,5; 5,0 e 10%), do padrão inseticida acefato e de água. As soluções assim obtidas foram pulverizadas em discos de couve colocados sobre agar em placas de Petri, contendo vinte pulgões adultos. Na sequência, as placas de Petri foram vedadas com filme plástico transparente, sendo este procedimento repetido para as duas espécies de afídeos. A avaliação do número de ninfas e adultos vivos ocorreu 1, 12, 24 e 72 horas após a pulverização dos tratamentos. Os extratos de coentro e fumo preparados na concentração de 10% demonstraram ação tóxica semelhante à do inseticida organofosforado acefato, sobre adultos e ninfas dos pulgões Brevicoryne brassicae e Myzus persicae. O coentro evidenciou-se como alternativa promissora que merece estudos detalhados, no tocante a atuação de seus princípios ativos e determinação de dosagens, a fim de disponibilizar um produto botânico seguro para o controle de insetos

Bioactivity And Chemical Composition Of The Essential Oil From The Leaves Of Guatteria Australis A.st.-hil.

Essential oil from the leaves of Guatteria australis was obtained by hydrodistillation, analyzed by Gas Chromatography coupled to Mass Spectromery (GC-MS) and their antiproliferative, antileishmanial, antibacterial, antifungal and antioxidant activities were also evaluated. Twenty-three compounds were identified among which germacrene B (50.66%), germacrene D (22.22%) and (E)-caryophyllene (8.99%) were the main compounds. The highest antiproliferative activity was observed against NCI-ADR/RES (TGI = 31.08 μg/ml) and HT-29 (TGI = 32.81 μg/ml) cell lines. It also showed good antileishmanial activity against Leishmania infantum (IC50 = 30.71 μg/ml). On the other hand, the oil exhibited a small effect against Staphylococcus aureus ATCC 6538, S. aureus ATCC 14458 and Escherichia coli ATCC 10799 (MIC = 250 μg/ml), as well as small antioxidant activity (457 μmol TE/g) assessed through ORACFL assay. These results represent the first report regarding chemical composition and bioactivity of G. australis essential oil.1-

Coenzyme Q10 supplementation acts as antioxidant on dystrophic muscle cells

Increased oxidative stress is a frequent feature in Duchenne muscular dystrophy (DMD). High reactive oxygen species (ROS) levels, associated with altered enzyme antioxidant activity, have been reported in dystrophic patients and mdx mice, an experimental model of DMD. In this study, we investigated the effects of coenzyme Q10 (CoQ10) on oxidative stress marker levels and calcium concentration in primary cultures of dystrophic muscle cells from mdx mice. Primary cultures of skeletal muscle cells from C57BL/10 and mdx mice were treated with coenzyme Q10 (5 μM) for 24 h. The untreated mdx and C57BL/10 muscle cells were used as controls. The MTT and live/dead cell assays showed that CoQ10 presented no cytotoxic effect on normal and dystrophic muscle cells. Intracellular calcium concentration, H2O2 production, 4-HNE, and SOD-2 levels were higher in mdx muscle cells. No significant difference in the catalase, GPx, and Gr levels was found between experimental groups. This study demonstrated that CoQ10 treatment was able to reduce levels of oxidative stress markers, such as H2O2, acting as an antioxidant, as well as decreasing abnormal intracellular calcium influx in dystrophic muscles cells. This study demonstrated that CoQ10 treatment was able to reduce levels of oxidative stress markers, such as H2O2, acting as an antioxidant, as well as decreasing abnormal intracellular calcium influx in dystrophic muscles cells. Our findings also suggest that the decrease of oxidative stress reduces the need for upregulation of antioxidant pathways, such as SOD and GSH24611751185CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal e Nível SuperiorCNPQ - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e TecnológicoFAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa Do Estado De São Paulo001Não temNão temThis study was financed in part by the Coordenação de Pessoal de Nivel Superior Brasil, (CAPES)–Finance Code 001, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Sao Paulo (FAPESP), CNPq and FAEPEX. L.H.R.M., A.R.F., and R.D.M. were the recipient of a FAPESP fellowship. D.S.M, T.A.H., and C.C.L are the recipient of a CAPES fellowshi