Evaluation of structural and functional changes of tight junctions in acute graft-versus host disease (GVHD)

Orientador: Erich Vinicius de PaulaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: INTRODUÇÃO: A doença do enxerto contra o hospedeiro aguda (DECHa) é a maior causa de morbidade e mortalidade precoce no transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH). A quebra da barreira epitelial intestinal na fase inicial do TCTH é reconhecida como um evento fisiopatológico crítico para a DECHa. Esta quebra permite a translocação de antígenos da luz intestinal para submucosa e estimula a ativação de linfócitos T do doador, os quais atuam como efetores da resposta imune responsável pela DECHa. O epitélio intestinal mantém sua função de barreira através de complexos juncionais, entre os quais as junções tight (JT). Estes complexos multiproteicos dinâmicos regulam a passagem de solutos, mediante a ativação de vias se sinalização por estímulos do meio externo. Nos últimos anos, as interações proteicas e os estímulos responsáveis pela regulação funcional das JT foram descritos detalhadamente, permitindo a exploração destes mecanismos nas doenças em que a quebra da barreira epitelial apresenta papel relevante. Apesar destes avanços, aspectos fundamentais da fisiopatologia da DECHa, tais como os mecanismos celulares e moleculares que permitem a translocação de antígenos do lúmen intestinal, e os mecanismo efetores finais que resultam em diarreias profusas, ainda não foram elucidados. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo de explorar alterações estruturais e funcionais da barreira epitelial intestinal na DECHa com foco em proteínas das junções tight. Paralelamente, utilizamos o mesmo modelo para estudar o efeito do heme, uma molécula que atua como ativador da resposta imune inata ou DAMP ("Danger associated molecular pattern") em outros contextos inflamatórios, sobre a barreira epitelial intestinal. RESULTADOS: Inicialmente, a análise retrospectiva das biopsias de 25 pacientes com DECHa GI permitiu caracterizar a associação da gravidade clínica dessa condição com a perda acentuada de criptas intestinais, mas não foi suficiente para avaliação da estados das JT. A avaliação mais detalhada destas estruturas no contexto da DECHa GI foi realizada através da imunofluorescência com marcação para a proteína da JT ZO-1, e por microscopia eletrônica, que evidenciaram alterações compatíveis com perda da integridade destas junções por ambas metodologias. Em seguida, demonstramos que o soro de pacientes com DECHa GI colhido após o condicionamento retardou a recuperação da integridade da barreira epitelial tendo como referência o efeito do soro colhido antes do condicionamento sobre esta mesma barreira. Além disso, o soro causou mudanças na localização da proteína ZO-1, que representa um elemento fundamental das JT. No que diz respeito aos efeitos do heme sobre a integridade da barreira epitelial intestinal, pudemos demonstrar que o heme foi capaz de induzir uma redução duradoura da integridade da barreira epitelial, e que heme e LPS possuem efeito sinérgico de quebra da barreira epitelial nestas células. CONCLUSÃO: Neste estudo, descrevemos as alterações histológicas mais frequentemente observadas em pacientes com DECHa GI, e apresentamos evidências morfológicas e funcionais da quebra da barreira epitelial intestinal como um dos mecanismos envolvidos com a fisiopatologia da DECHa. Paralelamente, também demonstramos o efeito do heme sobre a barreira epitelial intestinal, bem como sua sinergia com o LPSAbstract: INTRODUCTION: Acute host graft disease (GVHD) is the major cause of early morbidity and mortality in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). The breakdown of the intestinal epithelial barrier in the early phase of HSCT is recognized as a critical pathophysiological event for GVHD. This break allows the translocation the lumen of the intestinal to submucosal and stimulates the activation of donor T lymphocytes, which act as effectors of the immune response responsible for the GVHD. The intestinal epithelium maintains its barrier function through junctional complexes, among which the tight junctions (TJ). These dynamic multiprotein complexes regulate the passage of solutes, through the activation of pathways and signaling by stimuli from the external environment. In recent years, the protein interactions and the stimuli responsible for the functional regulation of TJ have been described in detail, allowing the exploration of these mechanisms in diseases in which the breakdown of the epithelial barrier plays a relevant role. Despite these advances, fundamental aspects of the pathophysiology of GVHD, such as the cellular and molecular mechanisms that allow the translocation of intestinal lumen antigens, and the final effector mechanisms that result in profuse diarrhea, have not yet been elucidated. In this context, this work aimed to explore structural and functional alterations of the intestinal epithelial barrier in the GVHD with a focus on tight junction proteins. In parallel, we used the same model to study the effect of heme, a molecule that acts as an activator of the innate immune response or DAMP (Danger associated molecular pattern) in other inflammatory contexts, on the intestinal epithelial barrier. RESULTS: Initially, the retrospective analysis of the biopsies of 25 patients with intestinal GVHD allowed characterizing the association of the clinical severity of this condition with the marked loss of intestinal crypts, but it was not enough to evaluate the TJ states. The more detailed evaluation of these structures in the context of the intestinal GVHD was performed by immunofluorescence with labeling for TJ ZO-1 protein, and by electron microscopy, which evidenced alterations compatible with loss of the integrity of these joints by both methodologies. Next, we demonstrate that serum from patients with intestinal GVHD harvested after conditioning delayed the recovery of epithelial barrier integrity based on the effect of serum harvested prior to conditioning on this same barrier. In addition, the serum caused changes in the localization of the ZO-1 protein, which represents a fundamental element of the TJ. Regarding the effects of heme on the integrity of the intestinal epithelial barrier, we could demonstrate that heme was able to induce a lasting reduction in the integrity of the epithelial barrier, and that heme and LPS have a synergistic effect of breaking the epithelial barrier in these cells. CONCLUSION: In this study, we describe the histological changes most frequently observed in patients with intestinal GVHD, and present morphological and functional evidence of intestinal epithelial barrier breakage as one of the mechanisms involved with the pathophysiology of GVHD. In parallel, we also demonstrated the effect of heme on the intestinal epithelial barrier, as well as its synergy with LPSDoutoradoPatologia ClinicaDoutora em Ciências Médicas01-P-3368/2017  CAPE

Análise dos efeitos do uso de furosemida em pacientes submetidos a cirurgias cardíacas com o uso de circulação extracorpórea: uma revisão sistemática

A circulação extracorpórea (CEC) é utilizada como auxílio aos diversos tipos de cirurgias, principalmente cardíacas. Além da substituição da função cardiopulmonar, é responsável ainda, pelo controle dos balanços ácido-base e hidroeletrolíticos. O uso de diuréticos de alça são escolha da equipe cirúrgica, pois esses fármacos influenciam no débito urinário do paciente no pós- cirúrgico. A análise dos efeitos do uso de furosemida que possam influenciar no pós-operatório do paciente é o objetivo deste trabalho, de modo que haja informação direta às equipes e suas escolhas, apresentando benefícios ou efeitos adversos em seu uso. Trata-se então de uma revisão sistemática da literatura, que utilizou as bases de dados “PubMed”, “Cochrane” e “Bireme”; com os descritores “cardiopulmonary bypass”, “furosemide” e “thoracic surgery”, para a busca de artigos apenas na língua inglesa, entre o intervalo dos anos de 2007 a 2017. Na primeira etapa da busca foram encontradas 17 publicações, os autores fizeram a leitura completa, encontraram os que estavam presentes em mais de uma plataforma, e após a aplicação dos critérios de inclusão e exclusão, restaram apenas 5 estudos que correspondiam aos objetivos propostos deste trabalho. No total dos artigos selecionados, foram analisados 4.845 pacientes. Dos cinco estudos, quatro foram classificados em dois tipos de categoria de acordo com o estágio da lesão renal, três por RIFLE, um AKIN, e um não apresentou critério de classificação. Os resultados obtidos apontam que ainda há uma escassez no estudo deste tipo de fármaco e que não há relação benéfica com seu uso, que este está associado principalmente a predisposição ao desenvolvimento de lesão renal. Em contrapartida, alguns estudos fora do intervalo selecionado, apresentaram um efeito reno- protetor associado. Com isto cabe a equipe cirúrgica uma análise sobre o paciente, identificando para cada indivíduo o melhor protocolo, a fim de garantir um melhor prognóstico.

Application of PCR for the diagnosis and monitoring of cutaneous and visceral leishmaniasis in the region of Campinas-SP and Teresina-PI

Orientador: Carlos Emílio LevyDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: INTRODUÇÃO: As leishmanioses são um conjunto de doenças parasitárias causadas por mais de vinte espécies de tripanossomatídeos do gênero Leishmania. Afetam animais (silvestres e domésticos) e o homem. No Brasil é uma doença com diversos agentes, reservatórios e vetores que apresenta diferentes padrões de transmissão e um conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos epidemiológicos, o que a torna de difícil controle. OBJETIVO: Utilizar a técnica de PCR para fins diagnósticos de Leishmaniose, tanto de amostras clínicas humanas (Campinas), como de amostras caninas procedentes das cidades de Campinas/SP e Teresina/PI. MÉTODOS: Foram encaminhadas ao Laboratório de Parasitologia do Hospital de Clínicas da Unicamp, 120 amostras humanas e 195 amostras caninas. A PCR foi realizada utilizando primers específicos para o gênero Leishmania ssp. e para as espécies L. (L.) infantum chagasi e L. (V.) braziliensis. RESULTADOS: Das 120 amostras humanas, 80 eram suspeitas de leishmaniose (43 obtidas de medula óssea e 37 de biópsias e/ou raspado de lesão tegumentar). Destas, 15 foram positivas na pesquisa direta e apenas 9 foram positivas na cultura e 20 apresentaram PCR positivo para gênero. Foram utilizadas 40 amostras como controle, sendo todas negativas para o PCR. As 15 amostras que foram positivas na pesquisa direta apresentaram positividade na PCR, sendo 7 identificadas como L. (L.) infantum chagasi, 7 L. (V.) braziliensis e 1 positiva apenas para o gênero Leishmania, esta sendo procedente de amostra de punção de medula óssea. A PCR realizada nas amostras caninas, quando comparada ao teste de triagem mostrou diferença de sensibilidade do método nas duas cidades de estudo, sendo que em Campinas foi observada maior sensibilidade da PCR (88,24%) [p=0,0455] quando comparada a casuística de Teresina (14,71%) [p<0.0001]. Na comparação da PCR com o teste confirmatório foram encontrados resultados discordantes entre as técnicas de PCR e Elisa (p=0.0027 para Campinas e p<0.0001 para Teresina) para os valores de sensibilidade (Campinas=100%/Teresina=21,74%), especificidade (Campinas=30,77% / Teresina=100%), VPP (Campinas=68,97% / Teresina=100%) e VPN (Campinas=100% / Teresina=37,94%). DISCUSSÃO E CONCLUSÃO: Para o diagnostico de LV e LT em humanos a PCR mostrou excelente concordância com os testes padrão ouro, com elevada sensibilidade e especificidade. Foi possível comprovar a ausência de reações cruzadas dos primers utilizados com outros parasitos filogeneticamente próximos. A PCR apresenta-se como uma ferramenta de considerável valor para a identificação das espécies envolvidas nas infecções em cães e humanos. No diagnóstico da leishmaniose visceral canina em cidades com perfil epidemiológico como Campinas onde o surto parece ser mais recente, o desempenho da PCR mostra-se muito útil na detecção de cães infectados. Nesta população o teste de triagem se mostrou mais sensível e específico que o teste confirmatório, tendo como referência a detecção do DNA do parasito pela PCR. No caso de Teresina, com provável padrão de doença canina endêmica de longa duração a PCR não se mostrou útil para diagnóstico, exceto para detecção de poucos cães com provável parasitemia ativa ou antigenemiaAbstract: BACKGROUND: Leishmaniasis is a group of parasitic diseases caused by over twenty species of trypanosomes of the genus Leishmania. Affect animals (wild and domestic) and man. In Brazil is a disease with many agents, reservoirs and vectors presenting different patterns of transmission and there is still limited knowledge on some epidemiological aspects, which makes it difficult to control. OBJECTIVE: Using PCR for leishmaniasis diagnostic purposes, from human clinical samples (Campinas) and canine samples coming from the cities of Campinas/SP and Teresina/PI . METHODS: In the Laboratory of Parasitology of the Hospital de Clinicas Unicamp, 120 human samples and 195 canine samples were processed. PCR was performed using primers specific for the genus Leishmania ssp. and for L. (L.) infantum chagasi and L. (V.) braziliensis species. RESULTS: Among the 120 human samples, 80 were suspected of leishmaniasis (obtained 43 from bone marrow biopsies and 37 from cutaneous lesion scrapings). Of these 80 samples, only 15 were positive on direct testing, 9 were positive in culture and 20 were positive for PCR for Leishmania genus. As control were used 40 samples, all negative for PCR. The 15 samples that were positive in the direct examination were also positive in PCR , 7 identified as L. (L.) infantum chagasi, 7 L. (V.) braziliensis and only 1 positive for genus Leishmania and negative for L. (L.) i. chagasi or L. (V.) braziliensis coming from a sample of bone marrow aspiration. The PCR performed in canine samples compared to the screening test showed difference in sensitivity in both cities. In Campinas was obtained higher sensitivity of PCR (88.24 %) [p = 0.0455] when compared with the series in Teresina (14.71 %) [p<0.0001]. When compared PCR with the confirmatory testing, discordant results were found between PCR and ELISA (p=0.0027 for Campinas and p<0.0001 for Teresina) for values of sensitivity (100 %=Campinas/Teresina = 21.74 % ), specificity (Campinas = 30.77 %/Teresina = 100 %), PPV (Campinas = 68.97 %/Teresina = 100 %) and VPN (Campinas = 100 %/ Teresina = 37.94 %). DISCUSSION AND CONCLUSION: PCR showed excellent agreement with the gold standard test for the diagnosis of human VL and TL with high sensitivity and specificity. It was possible to prove the absence of cross-reactivity of the primers with other phylogenetically close parasites. PCR is presented as a tool of considerable value to identify the species involved in infections in dogs and humans. In the diagnosis of canine visceral leishmaniasis in cities with epidemiological profile like Campinas, where the outbreak appears to be more recent, the performance of PCR proved to be very useful for the detection of infected dogs. In this population the screening test was more sensitive and specific than the confirmatory test, with the detection of the parasite DNA by PCR as reference. In the case of Teresina, with the probable pattern of endemic canine long-term illness, PCR was not useful for diagnosis, except for detection of few dogs with probable active parasitemia and antigenemiaMestradoSaude da Criança e do AdolescenteMestra em Ciência

Vacuum-assisted drainage in cardiopulmonary bypass: advantages and disadvantages

Revisão sistemática sobre drenagem assistida a vácuo na circulação extracorpórea, demonstrando seus benefícios, desvantagens, por relatos de casos e evidências sobre seus efeitos na microcirculação. Realizou-se pesquisa sistemática, no período de 1997-2012, nas bases de dados do PubMed-Medline, Lilacs e SciELO. Termos: "circulação extracorpórea", "vácuo", "drenagem", "cirurgia cardíaca" e suas correspondentes traduções, em condições variadas. Dos 70 artigos selecionados, 26 foram incluídos na revisão. Embora a drenagem assistida a vácuo possua potencial significante de complicações e exija tecnologia e profissionalismo respectivo adequado, prevaleceu na literatura revisada o conceito de que a drenagem assistida a vácuo contribuiu na redução no índice de transfusões, hemodiluições, melhor campo operatório, não aumento de hemólise significativa, redução de complicações pós-cirúrgicas, uso de menor prime e uso de cânulas de menor calibre

Intestinal Microsporidiosis In A Reference Center.

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Hypofibrinolysis induced by tranexamic acid does not influence inflammation and mortality in a polymicrobial sepsis model.

The biological relevance of fibrinolysis to the host response to sepsis is illustrated by pathogens such as S. pyogenes and Y. pestis, whose virulence factors are proteins that challenge the balance between pro- and anti-fibrinolytic factors of the host, and by the consistent finding of hypofibrinolysis in the early stages of sepsis. Whether this hypofibrinolytic response is beneficial or detrimental to the host, by containing the spread of pathogens while at the same time limiting the access of immune cell to infectious foci, is still a matter of debate. Tranexamic acid (TnxAc) is an antifibrinolytic agent that is being increasingly used to prevent and control bleeding in conditions such as elective orthopedic surgery, trauma, and post-partum-hemorrhage, which are frequently followed by infection and sepsis. Here we used a model of polymicrobial sepsis to evaluate whether hypofibrinolysis induced by TnxAc influenced survival, tissue injury and pathogen spread. Mice were treated with two doses of TnxAc bid for 48h, and then sepsis was induced by cecal ligation and puncture. Despite the induction of hypofibrinolysis by TnxAc, no difference could be observed in survival, tissue injury (measured by biochemical and histological parameters), cytokine levels or pathogen spread. Our results contribute with a new piece of data to the understanding of the complex interplay between fibrinolysis and innate immunity. While our results do not support the use of TnxAc in sepsis, they also address the thrombotic safety of TnxAc, a low cost and widely used agent to prevent bleeding

Role of innate immunity-triggered pathways in the pathogenesis of Sickle Cell Disease: a meta-analysis of gene expression studies

Despite the detailed characterization of the inflammatory and endothelial changes observed in Sickle Cell Disease (SCD), the hierarchical relationship between elements involved in the pathogenesis of this complex disease is yet to be described. Meta-analyses of gene expression studies from public repositories represent a novel strategy, capable to identify key mediators in complex diseases. We performed several meta-analyses of gene expression studies involving SCD, including studies with patient samples, as well as in-vitro models of the disease. Meta-analyses were performed with the Inmex bioinformatics tool, based on the RankProd package, using raw gene expression data. Functional gene set analysis was performed using more than 60 gene-set libraries. Our results demonstrate that the well-characterized association between innate immunity, hemostasis, angiogenesis and heme metabolism with SCD is also consistently observed at the transcriptomic level, across independent studies. The enrichment of genes and pathways associated with innate immunity and damage repair-associated pathways supports the model of erythroid danger-associated molecular patterns (DAMPs) as key mediators of the pathogenesis of SCD. Our study also generated a novel database of candidate genes, pathways and transcription factors not previously associated with the pathogenesis of SCD that warrant further investigation in models and patients of SCD5CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQFUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPES