Molecular and cellular mechanisms of temperature reception by primary afferents

Primary afferent neurons (PANs) provide an organism interface with the environment by conveying to the CNS information about temperature, mechanical and other challenges. Temperature perception is of interest as the underlying mechanisms remain largely unknown because of restrictions of biomedical experiments. Computer models provide a complementary tool to overcome some restrictions. We combined experimental and simulation studies to disclose biophysical mechanisms, by which thermosensitive PANs convert temperatures into generator potentials and the action potential (AP) firing

Species-Related Differences in the Properties of Receptor-Operated TRPC4 Channels in Intestinal Myocytes of Rodents

TRPC4 proteins form receptor-operated cation channels that are activated in synergy by M₂ and M₃ acetylcholine (ACh) receptors coupled to Gq/11 and Gi/o proteins, respectively. These channels are widely expressed in the brain and smooth muscles where they perform a number of important functions, including control of GABA release from the dendrites and cholinergic excitation of smooth muscles. The biophysical properties of TRPC4 currents directly activated by GTPγS in mouse cells remain mostly unknown. We, thus, aimed to investigate these channels in mouse ileal myocytes where a prominent TRPC4-mediated cation current termed mICAT is observed, and to compare the behavior of this current with that of the better studied mICAT in guinea-pig myocytes. Although the respective cation current responses to carbachol (CCh) at –50 mV (i.e., at the value close to the normal resting potential in these cells) were highly similar, mICAT in the mouse lacked the permissive action of intracellular Ca2+ on channel opening. The slope factor of the muscarinic cation conductance, which is a defining property of voltage-dependent behavior, was identical in both species. There were differences in the potential at which the current peaked at negative potentials, but not in the maximal current densities. Major differences were found in the kinetics of mICAT voltage-dependent relaxations, which were much faster in the mouse. The above rodent species employ two different strategies for the open probability increase by activated G-proteins; the mean open time was shorter in the mouse compared to that in the guinea-pig (15.1 ± 5.2 msec, n = 8, vs. 80.0 ± ± 19.7 msec, n = 9; P < 0.01). Correspondingly, the instantaneous frequency of channel opening was much higher in the mouse (154.1 ± 18.8 sec⁻¹ vs. 70.2 ± 7.3 sec⁻¹ in the guinea-pig; P < 0.001). These functional differences are based on the differences found in the corresponding TRPC4 amino acid sequences of the two rodent species, which are mainly clustered in the cytosolic C-terminus of TRPC4 protein. Keywords: muscarinic receptors, receptor-oПротеїни TRPC4 формують рецепторкеровані катіонні канали, які активуються синергічною дією на M₂ - та M₃ - ацетилхолінові рецептори, відповідно пов’язані з Gq/11- та Gi/o-протеїнами. Ці канали широко експресовані в мозку та гладеньких м’язах, де вони виконують численні функції, в тому числі забезпечуючи контроль вивільнення ГАМК із дендритів та холінергічне збудження гладеньких м’язів. Біофізичні властивості струмів через TRPC4- канали, індукованих у клітинах миші прямою дією ГТФγS, залишаються великою мірою невідомими. Тому ми досліджували ці канали в міоцитах тонкого кишківника миші, в яких спостерігається значний катіонний струм, опосередкований TRPC4 та названий mICAT. Ми порівнювали властивості даного струму з властивостями краще вивченого mICAT у міоцитах морської свинки. Незважаючи на те що катіонні струми після аплікації карбахолу при потенціалі –50 мВ (тобто при значенні, близькому до нормального потенціалу спокою в цих клітинах) були дуже подібними, вплив внутрішньоклітинного кальцію на відкривання досліджуваних каналів під час відведення mICAT у миші був відсутнім. Швидкість зміни мускарінової катіонної провідності, котра є визначальним фактором щодо потенціалзалежної поведінки каналів, у двох згаданих видів гризунів була практично ідентичною. Спостерігалися помітні розбіжності значень негативних потенціалів, при яких струм досягав максимуму, але максимальні щільності струмів були подібними. Найбільші відмінності були виявлені в кінетиці потенціалзалежної релаксації mICAT, котра у миші була значно швидшою. У вказаних видів гризунів використовуються дві відмінні стратегії підвищення вірогідності відкритого стану досліджуваних каналів при активації G-протеїнів. Середнє значення часу відкритого стану у миші було значно меншим порівняно з відповідним показником у морської свинки (15.1 ± 5.2 мс, n = 8, vs 80.0 ± 19.7 мс, n = 9; P < 0.01). Відповідно, у миші миттєва частота відкривань каналів була значно вищою, ніж у морської свинки (154.1 ± 18.8 с⁻¹ vs 70.2 ± ± 7.3 с⁻¹; P < 0.001). Ці функціональні різниці розглядаються як наслідок структурних розбіжностей відповідних послідовностей амінокислотних залишків у білках TRPC4 двох вказаних видів гризунів. Дані розбіжності в основному сконцентровані в цитозольних C-закінченнях первинних послідовностей протеїнів TRPC4

Pico145 inhibits TRPC4-mediated mICAT and postprandial small intestinal motility

In intestinal smooth muscle cells, receptor-operated TRPC4 are responsible for the majority of muscarinic receptor cation current (mICAT), which initiates cholinergic excitation-contraction coupling. Our aim was to examine the effects of the TRPC4 inhibitor Pico145 on mICAT and Ca2+ signalling in mouse ileal myocytes, and on intestinal motility. Ileal myocytes freshly isolated from two month-old male BALB/c mice were used for patch-clamp recordings of whole-cell currents and for intracellular Ca2+ imaging using Fura-2. Functional assessment of Pico145's effects was carried out by standard in vitro tensiometry, ex vivo video recordings and in vivo postprandial intestinal transit measurements using carmine red. Carbachol (50 µM)-induced mICAT was strongly inhibited by Pico145 starting from 1 pM. The IC50 value for the inhibitory effect of Pico145 on this current evoked by intracellularly applied GTPγS (200 µM), and thus lacking desensitisation, was found to be 3.1 pM, while carbachol-induced intracellular Ca2+ rises were inhibited with IC50 of 2.7 pM. In contrast, the current activated by direct TRPC4 agonist (-)-englerin A was less sensitive to the action of Pico145 that caused only ∼43 % current inhibition at 100 pM. The inhibitory effect developed rather slowly and it was potentiated by membrane depolarisation. In functional assays, Pico145 produced concentration-dependent suppression of both spontaneous and carbachol-evoked intestinal smooth muscle contractions and delayed postprandial intestinal transit. Thus, Pico145 is a potent GI-active small-molecule which completely inhibits mICAT at picomolar concentrations and which is as effective as trpc4 gene deficiency in in vivo intestinal motility tests