Oxydation biocatalytique de liaison C-H non activée pour la synthèse de dérivés bêta-hydroxylamines (application à la synthèse d'acides aminés non protéinogènes)

Le travail présenté dans ce manuscrit porte sur la recherche de nouveaux membres de la famille des dioxygénases a-cétoglutarate et fer dépendantes (a-KAO) et leur application en synthèse organique. Dans un premier, ce travail a consisté à chercher de nouvelles enzymes selon une approche génomique basée sur l homologie de séquence et le partage d un motif InterPro. Deux criblages haut débit avec 79 et 127 enzymes candidates ont ensuite été effectués sur des panels constitués respectivement de 23 et 36 substrats, structurellement plus ou moins proches des substrats métaboliques. Huit nouvelles a-KAO ont ainsi pu être découvertes. Parmi ces huit nouvelles a-KAO, quatre ont été étudiées plus en détail. Après optimisation des conditions de réaction pour chaque enzyme, des montées en échelle ont été réalisées pour caractériser les produits formés. A partir de ces quatre enzymes, la (3S)-3-hydroxy-L-lysine, un dérivé cyclisé de la (4R)-4-hydroxy-L-lysine, (3S)-3-hydroxy-L-ornithine et un dérivé de la (3S)-3-hydroxy-L-arginine ont pu être produits. Nous avons proposé une synthèse biocatalytique de mono et dihydroxydiamines en couplant une ou deux a-KAO avec une décarboxylase. Les (2S)-1,5-diamino-2-pentanol, 1,5-diamino-3-pentanol, (2S)-1,4-diamino-2-butanol et (2S,3S)-1,5-diamino-2,3-pentanediol ont ainsi été obtenus avec de bonnes conversions.The work described in this manuscript deals with the search of new members of the a-ketoglutarate and Iron-dependent dioxygenases family (a-KAO) and their applications in organic synthesis. The first part of this work presents the search of new enzymes through a genomic approach based on sequence homology and InterPro motif sharing. Two high-throughput screenings with 79 and 127 candidate enzymes have been performed on 23 and 36 substrates more or less structurally close to known metabolic substrates. 8 new a-KAOs have been discovered. Among these new enzymes, four were studied in more details. After optimization of the enzymatic reaction conditions for each enzyme, scale-up allowed to obtain compounds for isolation and characterization. With these four enzymes, (3S)-3-hydroxy-L-lysine, (4R)-4-hydroxy-L-lysine as its cyclic derivative, (3S)-3-hydroxy-L-ornithine and a derivative of (3S)-3-hydroxy-L-arginine were produced. Two of the new a-KAO were combined in a cascade process to afford the (3R,4R)-3,4-dihydroxy-L-lysine as its cyclic derivative. We proposed a biocatalytic synthesis of mono and hydroxydiamines by coupling one or two a-KAO with a decarboxylase enzyme. (2S)-1,5-diamino-2-pentanol, 1,5-diamino-3-pentanol, (2S)-1,4-diamino-2-butanol and (2S,3S)-1,5-diamino-2,3-pentanediol were obtained with good overall conversions.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocSudocFranceF

Nouvelles activités nitrilase (application à la synthèse de produits d'intérêt)

Le travail décrit dans ce manuscrit porte sur la recherche de nouvelles activités enzymatiques nitrilases et plus particulierement a-aminonitrilases. Le but de ce travail était, dans un premier temps, de tester un grand nombre de nitrilases candidates sur un large panel de nitriles pour appréhender leurs activités et établir un catalogue de nouvelles activités nitrilases. Dans un second temps, la recherche de nouvelles activités a-aminonitrilase a été menée dans l objectif de réaliser la synthèse d a-aminoacides par dédoublement cinétique dynamique assistée par couplage avec une racemase. 163 protéines ont été sélectionnées par une approche génomique, et testées sous forme de lysat cellulaire à l aide d un test enzymatique couplé à la glutamate deshydrogénase sur 28 nitriles répartis en 7 familles (a-aminonitriles exclus). Le grand nombre de résultats positifs obtenus à l issu du criblage nous a permis d évaluer les activités nitrilases et d établir un catalogue de ces activités et d envisager l utilisation de certaines de ces nouvelles nitrilases dans la synthèse de synthons chimiques. Après sélection de 38 nitrilases et vérification de leurs activités sur enzymes purifiées, 8 nitrilases ont été testées sur 5 nouveaux nitriles déclinés du 3-phénylpropanenitrile. Une synthèse énantiospécifique de b-ester acide précurseur possible de quinolines fonctionnalisées a été réalisée. La déclinaison des dinitriles a également été abordée, 12 nitrilases sélectionnées ont été testées sur 6 dinitriles. Une nouvelle nitrilase nous a permis de réaliser la désymétrisation de l iminodiacétonitrile par monohydrolyse. Enfin, de nouvelles activités nitrilases ont été observées sur des cyclooxonitriles pour la formation de plateformes chirales fonctionnalisées. Selon une autre approche génomique, 425 nitrilases candidates ont été selectionnées et testées (en plus les 163 nitrilases du précédent criblage) sous forme de lysat cellulaire grâce à la mise au point d un suivi de l activité nitrilase par dérivatisation et analyse par LC-MS sur 6 a-aminonitriles précurseurs d a-aminoacides naturels. Le criblage a permis de mettre en évidence de nouvelles activités a-aminonitrilases sur le phénylglycinonitrile et le 2-amino pentanenitrile. De nouveaux nitriles déclinés du phénylglycinonitrile, précurseurs d a-aminoacides d interêt pharmacologique, ont été téstés sur 4 a-aminonitrilases.The work described in this manuscript deals with on the search of new nitrilase activities especially a-aminonitrilases. In a first step, the aim was to build a catalog of nitrilase activities. In a second step, the search of new a-aminonitrilase activities was carried out for the synthesis of a-aminoacids by dynamic kinetic resolution with a racemase. Following a genomic approach, 163 proteins were selected and screened as cell lysate. The nitrilase activity was monitored by coupled enzymatic assay with glutamate dehydrogenase on 25 nitriles representative of the structural diversity. The large majority of proteins showed to be promiscuous towards the substrates. The best activities were validated using purified enzymes. Applications to the biocatalyzed synthesis of two building blocks, enantiomerically enriched acid (R)-4-methoxy-4oxo-3-phenylbutanoic acid and (S)-3-oxocyclopentanecarboxylic and the desymmetrization of iminodiacetonitrile by monohydrolyse, were performed. Through selection by a broader genomic approach, 588 candidates nitrilases were then tested on six a-aminonitriles. Analytical monitoring providing access to both conversion and enantiospecificity was developed by LC-MS. Six proteins were found to be active towards two substrates allowing applications to the synthesis of phenylglycine analogs with pharmacological properties.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocSudocFranceF

Biocatalytic reductive amination by native Amine Dehydrogenases to access short chiral alkyl amines and amino alcohols

Small optically active molecules, and more particularly short-chain chiral amines, are key 20 compounds in the chemical industry and precursors of various pharmaceuticals. Their chemo-21 biocatalytic production on a commercial scale is already established, mainly through lipase-22 catalyzed resolutions leading to ChiProsTM products among others. Nevertheless, their 23 biocatalytic synthesis still remains challenging for very short-chain C4 to C5 amines due to low 24 enantiomeric excess. To complement the possibilities recently offered by transaminases, this 25 work describes alternative biocatalytic access using amine dehydrogenases (AmDHs). Without 26 any protein engineering, some of the already described wild-type AmDHs (CfusAmDH, 27 MsmeAmDH, MicroAmDH and MATOUAmDH2) were shown to be efficient for the synthesis 28 of hydroxylated or unfunctionalized small 2-aminoalkanes. Conversions up to 97.1% were 29 reached at 50 mM, and moderate to high enantioselectivities were obtained, especially for (S)-30 1-methoxypropan-2-amine (98.1%), (S)-3-aminobutan-1-ol (99.5%), (3S)-3-aminobutan-2-ol 31 (99.4%) and the small (S)-butan-2-amine (93.6%) with MsmeAmDH. Semi-preparative scale 32 up experiments were successfully performed at 150 mM substrate concentrations for the 33 synthesis of (S)-butan-2-amine and (S)-1-methoxypropan-2-amine, the latter known as “(S)-34 MOIPA”. Modelling studies provided some preliminary results explaining the basis for the 35 challenging discrimination between similarly sized substituents in the active sites of these 36 enzymes

Native amine dehydrogenases can catalyze the direct reduction of carbonyl compounds to alcohols in the absence of ammonia

Native amine dehydrogenases (nat-AmDHs) catalyze the (S)-stereoselective reductive amination of various ketones and aldehydes in the presence of high concentrations of ammonia. Based on the structure of CfusAmDH from Cystobacter fuscus complexed with NADP+ and cyclohexylamine, we previously hypothesized a mechanism involving the attack at the electrophilic carbon of the carbonyl by ammonia followed by delivery of the hydride from the reduced nicotinamide cofactor on the re-face of the prochiral ketone. The direct reduction of carbonyl substrates into the corresponding alcohols requires a similar active site architecture and was previously reported as a minor side reaction of some nat-AmDHs and variants. Here we describe the ketoreductase (KRED) activity of a set of nat-AmDHs and variants, which proved to be significant in the absence of ammonia in the reaction medium but negligible in its presence. Conducting this study on a large set of substrates revealed the heterogeneity of this secondary KRED activity, which was dependent upon the enzyme/substrate pairs considered. In silico docking experiments permitted the identification of some relationships between KRED activity and the structural features of the enzymes. Kinetic studies of MsmeAmDH highlighted the superior performance of this nat-AmD

Suomen Teollisuussijoitus Oy:n (Tesi) arviointi

Arvioinnin kohteena on ollut työ- ja elinkeinoministeriön omistajaohjauksessa toimiva Suomen Teollisuussijoitus Oy:n (Tesi). Tesi on vuonna 1995 perustettu valtion omistama pääomasijoitusyhtiö, joka tekee vähemmistösijoituksia rahastoihin ja kohdeyrityksiin samoin ehdoin yksityisten sijoittajien kanssa. Arviointi tarkastelee Tesin toiminnan tehokkuutta, vaikuttavuutta ja yhteistyötä osana julkisen yritysrahoituksen kokonaisuutta pääomasijoitusmarkkinoilla vuosina 2015–2022. Pitkäjänteisen valtiollisen sijoittajan merkitys on korostunut epävarmoissa markkinatilanteissa ja markkinahäiriöissä. Viime vuosina erityisesti ilmastokriisi, koronapandemia ja Ukrainan sota ovat korostaneet Tesin roolia yhteiskunnallisten haasteiden ratkaisemisessa ja akuuttien markkinahäiriöiden tasaajana. Tesin toiminta muun muassa koronapandemian yhteydessä on laajasti koettu onnistuneena ja tärkeänä. Tesin rooli suomalaisessa pääomasijoitusmarkkinassa on merkittävä ja sen toiminta koetaan laadukkaana ja asiantuntevana. Kriittiset näkemykset liittyvät lähinnä Tesin koettuun portinvartijarooliin uusien rahastojen perustamisessa, sekä jossain määrin suoriin sijoituksiin. Tesillä on myös suuri merkitys tiedon tuottajana, sparraajana ja verkostojen rakentajana. Arviointi sisältää suosituksia sekä Tesin toiminnan kehittämiseksi että koko julkisen pääomasijoitustoiminnan vaikuttavuuden parantamiseksi

Native amine dehydrogenases can catalyze the direct reduction of carbonyl compounds to alcohols in the absence of ammonia

Native amine dehydrogenases (nat-AmDHs) catalyze the (S)-stereoselective reductive amination of various ketones and aldehydes in the presence of high concentrations of ammonia. Based on the structure of CfusAmDH from Cystobacter fuscus complexed with Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+) and cyclohexylamine, we previously hypothesized a mechanism involving the attack at the electrophilic carbon of the carbonyl by ammonia followed by delivery of the hydride from the reduced nicotinamide cofactor on the re-face of the prochiral ketone. The direct reduction of carbonyl substrates into the corresponding alcohols requires a similar active site architecture and was previously reported as a minor side reaction of some native amine dehydrogenases and variants. Here we describe the ketoreductase (KRED) activity of a set of native amine dehydrogenases and variants, which proved to be significant in the absence of ammonia in the reaction medium but negligible in its presence. Conducting this study on a large set of substrates revealed the heterogeneity of this secondary ketoreductase activity, which was dependent upon the enzyme/substrate pairs considered. In silico docking experiments permitted the identification of some relationships between ketoreductase activity and the structural features of the enzymes. Kinetic studies of MsmeAmDH highlighted the superior performance of this native amine dehydrogenases as a ketoreductase but also its very low activity towards the reverse reaction of alcohol oxidation

A Novel Acyl-CoA Beta-Transaminase Characterized from a Metagenome

BACKGROUND: Bacteria are key components in all ecosystems. However, our knowledge of bacterial metabolism is based solely on the study of cultivated organisms which represent just a tiny fraction of microbial diversity. To access new enzymatic reactions and new or alternative pathways, we investigated bacterial metabolism through analyses of uncultivated bacterial consortia. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: We applied the gene context approach to assembled sequences of the metagenome of the anaerobic digester of a municipal wastewater treatment plant, and identified a new gene which may participate in an alternative pathway of lysine fermentation. CONCLUSIONS: We characterized a novel, unique aminotransferase that acts exclusively on Coenzyme A (CoA) esters, and proposed a variant route for lysine fermentation. Results suggest that most of the lysine fermenting organisms use this new pathway in the digester. Its presence in organisms representative of two distinct bacterial divisions indicate that it may also be present in other organisms